保藏方法不一樣，活化方法就不一樣，都是一一對應(yīng)的。我們不能強(qiáng)制性的張冠李戴，那樣做出來試驗(yàn)效果會有一定折扣。為了這個折扣，我們有必要探討一下菌種保藏方法和不同保藏方法對應(yīng)的活化方法。
一、微生物菌種保藏的目的
盡可能的保持菌種的原有性狀和生理活性，不變異、不死亡、不污染、不退化。
菌種保藏最重要的目的就在于如何保持優(yōu)良菌種其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。
二、微生物菌種保藏的原理
1. 使微生物的代謝作用降至極低限度，使其處于不活躍的休眠狀態(tài)。通過降低微生物體內(nèi)的代謝，抑制生長繁殖，從而延長菌種的生命，減少變異。2. 從微生物本身來說，就是要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用他們的休眠體，比如說芽孢、孢子等。從環(huán)境條件來說，就是要創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境條件，比如低溫、干燥、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。大多數(shù)菌種的保藏方法都是根據(jù)這些因素或其中部分因素而設(shè)計(jì)的。
3. 微生物具有易異變的特性，在保藏過程必須使微生物代謝處于最不活躍的狀態(tài)但又不死亡，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異或少發(fā)生變異而又保持生命活力。
三、菌種保藏方法和不同保藏方法對應(yīng)的活化方法
（一）斜面保藏法和活化
1. 斜面保藏法操作步驟
斜面保藏法的原理：將斜面保存在4℃條件下，創(chuàng)造低溫環(huán)境，降低菌種活力。再加上斜面接種面積大，開口小，也相應(yīng)地減少了污染的機(jī)會。斜面制備好后，最好在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，檢驗(yàn)是否有污染。
平板轉(zhuǎn)接斜面和斜面轉(zhuǎn)接斜面，都是沒有問題，但一定要確保保藏的菌種沒有污染后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)接。細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的短期保藏。
一般情況下，近期兩個月內(nèi)不可能使用、也有可能使用的菌種，都可以采用斜面保藏法保藏。
(4)保藏期
一般保藏期為兩個月，最好不超過兩個月。時間過長，斜面脫水，菌種也會脫水死亡。
但也要根據(jù)情況進(jìn)行判斷，比如說，斜面沒有什么變化，菌種也沒有明顯污染，也可以繼續(xù)保藏，但最好轉(zhuǎn)接出來較為妥當(dāng)。一般情況，細(xì)菌一個月，酵母菌、放線菌等兩個月。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡便，沒有復(fù)雜的工序，不需要特殊設(shè)備，成本低，容易觀察，隨時觀察菌種的狀態(tài)，復(fù)蘇方便。
制作斜面一般用玻璃試管，比較透明，可以定期觀察菌種變化，如果發(fā)現(xiàn)污染或斜面脫水等狀況，立即轉(zhuǎn)種。
(6)缺點(diǎn)
保藏期短，菌種容易變異，易污染。
因斜面上只有固體培養(yǎng)基，沒有特殊的保護(hù)措施，所以培養(yǎng)基本身會發(fā)生變化，因保藏期短，就需要經(jīng)常傳代，傳代過程中增加污染的機(jī)會。
2. 斜面保藏菌種活化
斜面保藏法活化菌種比較簡單，直接用接種環(huán)挑取單菌落，采用“Z”字劃線法在斜面上連續(xù)劃線，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)完成保存至4℃保存。
（二）甘油管保藏法和活化
1.甘油管保藏法操作步驟
甘油管保藏是實(shí)驗(yàn)室常用的菌種保藏方法，它的原理在于，一定濃度的甘油，可以降低水的結(jié)冰溫度，有效地防止細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶，甘油還可以與細(xì)胞內(nèi)部分子結(jié)合，從而形成細(xì)胞的保護(hù)層，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。此外，甘油還是一種有機(jī)碳源，可以為細(xì)胞提供一定量的碳源和能源，使其保持活力狀態(tài)。
甘油比較粘稠，一般采用質(zhì)量比配制即可。
甘油管保藏法中，甘油的終濃度20%-30%即可。
值得注意的是，配好后一定要混勻，甘油密度比較大，會沉淀到底部，如果不混勻，滅菌效果可能不太好。
(2)甘油管保藏
液體菌種：將培養(yǎng)好的液體菌種和甘油按比例混勻，一般甘油的終濃度20%-30%。
我一般使用50%甘油和菌液1:1混勻，-80℃保藏即可。
平板或斜面菌種：用無菌水重懸菌種后，與50%甘油1:1混勻，-80℃保藏即可。
通常使用甘油的終濃度在20%~30%，該范圍外的濃度會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，質(zhì)粒會很容易丟失，甘油濃度太低起不到作用，太高又會影響菌種活性。
一般保藏時間為一年。在實(shí)際操作中，一年以上也沒問題。操作簡單，保藏期較長，菌種不容易發(fā)生變異。不容易觀察，不易監(jiān)測菌種變化，不宜反復(fù)凍融。將甘油管從-80℃取出，融化后，直接用接種環(huán)挑取一環(huán)，采用劃線法在固體培養(yǎng)基上劃線，適宜溫度下倒置培養(yǎng)即可�；蛘哂脽o菌水適當(dāng)稀釋后涂布至平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)。
小提示：
一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍快化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，直接放入37℃快速融化后使用。
另一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍慢化”，即-80℃保藏前，先-20℃預(yù)凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，逐級融化后使用。
實(shí)際使用時，甘油管直接-80℃冷凍保藏，使用時取出來直接用手捂熱使用，也是符合第一種說法的。效果到底哪種方式好，還需要繼續(xù)研究，等待進(jìn)一步數(shù)據(jù)。
（三）穿刺保藏法和活化
1.穿刺保藏法操作步驟
穿刺保藏法原理是缺氧和低溫，即菌種保存在半固體培養(yǎng)基內(nèi)部，造成缺氧環(huán)境，然后保存于4℃，延長菌種時間。
(1)制備半固體培養(yǎng)基
半固體培養(yǎng)基跟固體培養(yǎng)基的區(qū)別在于瓊脂粉含量不同，前者瓊脂粉含量1%，后者含量1.5%-2%。
半固體培養(yǎng)基添加至無菌試管約1/3處，營養(yǎng)不宜太豐富。值得注意的是，半固體培養(yǎng)基配制好后需要豎起來，不需要擺斜面。
(2)接種
用接種針挑取少量細(xì)菌，從半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入，直至接近半固體培養(yǎng)基1/2處自上而下穿刺，不要穿透，然后沿原穿刺線將接種針退出，穿入培養(yǎng)基若干次，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待微生物生長良好后，用2毫米無菌液體石蠟覆蓋，以創(chuàng)造缺氧環(huán)境并4℃保藏。
有的菌種保存時間至少可以達(dá)到1 年，有的菌種甚至能達(dá)到20 年之久。適用于工程大腸桿菌等細(xì)菌，操作簡便，保存時間較長。
(6)缺點(diǎn)
比較耗費(fèi)空間，不便于攜帶。
2.穿刺保藏菌種活化
用接種環(huán)沿著菌種方向穿入，挑取菌種，轉(zhuǎn)接至斜面上或平板培養(yǎng)基上，或加入無菌水搖晃，稀釋涂布即可。
（四）液體石蠟保藏法
液體石蠟保藏法實(shí)際上是斜面保藏法的一種改進(jìn)形式。它的原理基于斜面保藏菌的基礎(chǔ)上，覆蓋一層液體石蠟，創(chuàng)造缺氧環(huán)境而保存于4℃。
根據(jù)需要，將液體石蠟進(jìn)行分裝密封，放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min，滅菌完成后放置于40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，約4天，或105℃烘箱中1h，待水分蒸發(fā)完全后，備用。將無菌干燥的液體石蠟注入上述培養(yǎng)好的斜面上，加入石蠟的量以高于斜面頂端1cm為宜，再將試管密封，直立于4℃左右冷藏保存。覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。要定期添加石蠟保證斜面處于液面以下。
(4)保藏時間
保藏時間至少可以達(dá)到1年，甚至更長。
一般情況，不產(chǎn)芽孢細(xì)菌保藏1年，芽孢菌、放線菌、霉菌可保藏2年，酵母菌可保藏1-2年。
需要直立放置，比較耗費(fèi)空間，不便于攜帶。將保藏的斜面取出來，用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，適當(dāng)在試管內(nèi)壁輕點(diǎn)幾下，減少石蠟量，然后采用劃線法接種于新鮮平板上培養(yǎng)，待生長良好，再次傳代，培養(yǎng)。(2)移植菌種時，接種針上帶有石蠟和菌體，火焰滅菌時易飛賤、爆發(fā)，嚴(yán)防感染。(3)由于取出的菌種帶有一定量的液體石蠟，生長較慢且有粘性，因此，需要傳代2次。
（五）沙土管保藏法
沙土管干燥保藏法的原理是在沙土干燥條件下微生物細(xì)胞代謝活動減緩，繁殖速度受到抑制，這樣減少菌株突變，延長菌株存活時間。將培養(yǎng)好的菌種與無菌沙土混合，使菌體吸附在沙土載體上，干燥后保存。
1.沙土管保藏法
(1)處理沙土
將沙和土洗凈、烘干、過40目篩子，將沙與土以2:1的比例混合、分裝（每管1g沙土），滅菌，烘干。
當(dāng)孢子成熟后，用無菌水洗下制成孢子懸液，備用
(3)抽干、封口
將孢子懸液加入無菌的沙土管中，每管0.5mL，通過減壓干燥的方式去除沙土管中水分，直至水分被抽干，最后用石蠟或橡膠塞封口。
沙土管主要是通過創(chuàng)造干燥和寡營養(yǎng)的條件來保藏菌種。操作的時候應(yīng)該注意抽干一步務(wù)必要快，盡量在12h內(nèi)完成，防止孢子萌發(fā)，降低保藏效果。兩年左右，根據(jù)菌種特性，保藏時間可能更長。適用于能產(chǎn)生孢子的微生物，如霉菌、放線菌，能形成芽孢的芽孢桿菌也可以采用該方法。保藏效果好，適用性也較廣泛，在抗生素生產(chǎn)工廠應(yīng)用廣泛。取出少量沙土顆粒，放入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，或在固體培養(yǎng)基表面涂抹后培養(yǎng)。(1)需要選擇適合的沙土材料，排水性好、顆粒細(xì)小均勻、無害菌和病原菌，并且不含明顯異味。
(2)嚴(yán)格消毒和無菌操作。
（六）冷凍真空干燥保藏法
冷凍真空干燥保藏法的原理是將菌種冷凍，在減壓下利用升華作用去除水分，使細(xì)胞的生理活動趨于停止，從而使菌種長期維持存活的狀態(tài)。
1.冷凍真空干燥保藏法
(1)制備菌懸液
將處于成熟期的微生物培養(yǎng)物懸浮于無菌的脫脂奶粉或者海藻糖等保護(hù)劑中制成濃菌液，分裝到無菌的安瓿瓶中。將上述安瓿瓶放置于低溫冰箱中冷凍，達(dá)到預(yù)定溫度后對濃菌液進(jìn)行冷凍干燥處理，之后在真空狀態(tài)下融封安瓿瓶，于20℃保藏。五到十年，因保藏期較長，一定要標(biāo)記清楚，以免遺忘。適用于大批量菌種的長期保存。該保藏法是目前適用范圍最廣，保藏效果最好的方法，如果需要長期保藏就選擇這種方法。適用范圍廣，保藏效果好，存活率高，變異小，便于攜帶。因涉及到冷凍抽真空設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室不具備條件，需要到專門保藏機(jī)構(gòu)保藏，成本增加。
先用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用酒精燈火焰將安瓿管頂端適度加熱，然后用移液器取少量無菌水，將無菌水滴至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，最后用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
先用移液器吸取0.3-0.5mL適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使菌體溶解呈懸浮狀，然后取0.1-0.2mL菌體懸浮液，移植于適宜的斜面或平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，適宜的溫度下培養(yǎng)。
（七）液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法主要是利用微生物在低于-130°C的低溫下新陳代謝趨于停止的原理，在液氮中（-196°C的超低溫下）有效地進(jìn)行菌種保藏的方法。
離心收集對數(shù)生長期微生物細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基重懸微生物細(xì)胞。一般使用20%甘油和上述菌懸液等體積混勻，加入無菌的安瓿瓶中。將上述安瓿瓶緩慢預(yù)冷，最后移至液氮罐中的液相（-196℃）或氣象相（-156℃）作長期超低溫保藏。需要液氮罐等特殊設(shè)備，且管理費(fèi)用高、操作較復(fù)雜、攜帶不便。
四、菌種保藏共同點(diǎn)
2.所保藏的微生物在保藏時處于良好的狀態(tài)。3.防止退化的發(fā)生。所以，保藏期一到，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)接重新保種。
總之，菌種保藏是微生物學(xué)的重中之重，根據(jù)微生物的習(xí)性和使用時間，選擇合適的保藏方法。
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