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微生物菌種保藏與活化技術(shù)指南

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-06-14
核心提示: 保藏方法不一樣,活化方法就不一樣,都是一一對應(yīng)的。我們不能強(qiáng)制性的張冠李戴,那樣做出來試驗(yàn)效果會有一定折扣。為了這
 保藏方法不一樣,活化方法就不一樣,都是一一對應(yīng)的。我們不能強(qiáng)制性的張冠李戴,那樣做出來試驗(yàn)效果會有一定折扣。為了這個折扣,我們有必要探討一下菌種保藏方法不同保藏方法對應(yīng)的活化方法。

一、微生物菌種保藏的目的

盡可能的保持菌種的原有性狀和生理活性,不變異、不死亡、不污染、不退化。

菌種保藏最重要的目的就在于如何保持優(yōu)良菌種其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定,滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要

二、微生物菌種保藏的原理

1. 使微生物的代謝作用降至極低限度,使其處于不活躍的休眠狀態(tài)。通過降低微生物體內(nèi)的代謝,抑制生長繁殖,從而延長菌種的生命,減少變異。
2. 從微生物本身來說,就是要挑選典型菌種的優(yōu)良純種,最好采用他們的休眠體,比如說芽孢、孢子等。從環(huán)境條件來說,就是要創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境條件,比如低溫、干燥、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。大多數(shù)菌種的保藏方法都是根據(jù)這些因素或其中部分因素而設(shè)計(jì)的。

3. 微生物具有易異變的特性,在保藏過程必須使微生物代謝處于最不活躍的狀態(tài)但又不死亡,才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異或少發(fā)生變異而又保持生命活力。

三、菌種保藏方法不同保藏方法對應(yīng)的活化方法

(一)斜面保藏法和活化

1. 斜面保藏法操作步驟

斜面保藏法的原理:將斜面保存在4℃條件下,創(chuàng)造低溫環(huán)境,降低菌種活力。再加上斜面接種面積大,開口小,也相應(yīng)地減少了污染的機(jī)會。
(1)制備斜面
斜面制備好后,最好在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天,檢驗(yàn)是否有污染
(2)斜面接種
平板轉(zhuǎn)接斜面和斜面轉(zhuǎn)接斜面,都是沒有問題,但一定要確保保藏的菌種沒有污染后,再進(jìn)行轉(zhuǎn)接。
(3)適用對象
細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的短期保藏。

一般情況下,近期兩個月內(nèi)不可能使用、也有可能使用的菌種,都可以采用斜面保藏法保藏。

(4)保藏期

一般保藏期為兩個月,最好不超過兩個月。時間過長,斜面脫水,菌種也會脫水死亡。
但也要根據(jù)情況進(jìn)行判斷,比如說,斜面沒有什么變化,菌種也沒有明顯污染,也可以繼續(xù)保藏,但最好轉(zhuǎn)接出來較為妥當(dāng)。
一般情況,細(xì)菌一個月,酵母菌、放線菌等兩個月。

(5)優(yōu)點(diǎn)

操作簡便,沒有復(fù)雜的工序,不需要特殊設(shè)備,成本低,容易觀察,隨時觀察菌種的狀態(tài),復(fù)蘇方便。

制作斜面一般用玻璃試管,比較透明,可以定期觀察菌種變化,如果發(fā)現(xiàn)污染或斜面脫水等狀況,立即轉(zhuǎn)種。

(6)缺點(diǎn)

保藏期短,菌種容易變異,易污染。

因斜面上只有固體培養(yǎng)基,沒有特殊的保護(hù)措施,所以培養(yǎng)基本身會發(fā)生變化,因保藏期短,就需要經(jīng)常傳代,傳代過程中增加污染的機(jī)會。

2. 斜面保藏菌種活化

斜面保藏法活化菌種比較簡單,直接用接種環(huán)挑取單菌落,采用“Z”字劃線法在斜面上連續(xù)劃線,放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待培養(yǎng)完成保存至4℃保存。

(二)甘油管保藏法和活化

1.甘油管保藏法操作步驟

甘油管保藏是實(shí)驗(yàn)室常用的菌種保藏方法,它的原理在于,一定濃度的甘油,可以降低水的結(jié)冰溫度,有效地防止細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶,甘油還可以與細(xì)胞內(nèi)部分子結(jié)合,從而形成細(xì)胞的保護(hù)層,起到保護(hù)細(xì)胞的作用。此外,甘油還是一種有機(jī)碳源,可以為細(xì)胞提供一定量的碳源和能源,使其保持活力狀態(tài)。

(1)準(zhǔn)備甘油

甘油比較粘稠,一般采用質(zhì)量比配制即可。

甘油管保藏法中,甘油的終濃度20%-30%即可。

值得注意的是,配好后一定要混勻,甘油密度比較大,會沉淀到底部,如果不混勻,滅菌效果可能不太好。

(2)甘油管保藏

液體菌種:將培養(yǎng)好的液體菌種和甘油按比例混勻,一般甘油終濃度20%-30%。

我一般使用50%甘油和菌液1:1混勻,-80℃保藏即可。

平板或斜面菌種:用無菌水重懸菌種后,與50%甘油1:1混勻,-80℃保藏即可。

通常使用甘油的終濃度在20%~30%,該范圍外的濃度會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,質(zhì)粒會很容易丟失,甘油濃度太低起不到作用,太高又會影響菌種活性。

(3)適用對象
幾乎適用所有菌種保藏,中長期保藏。
半年到一年內(nèi)可能用到的菌種。
(4)保藏時間
一般保藏時間為一年。在實(shí)際操作中,一年以上也沒問題。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡單,保藏期較長,菌種不容易發(fā)生變異。
(6)缺點(diǎn)
不容易觀察,不易監(jiān)測菌種變化,不宜反復(fù)凍融。
2.甘油管菌種活化
將甘油管從-80取出,融化后,直接用接種環(huán)挑取一環(huán),采用劃線法在固體培養(yǎng)基上劃線,適宜溫度下倒置培養(yǎng)即可;蛘哂脽o菌水適當(dāng)稀釋后涂布至平板培養(yǎng)基中,培養(yǎng)。

小提示:

一種說法,甘油管保藏菌種需要“慢凍快化”,即-80℃保藏前,先-20℃預(yù)凍,再放入-80保藏;取出使用時,直接放入37℃快速融化后使用。
另一種說法,甘油管保藏菌種需要“慢凍慢化”,即-80℃保藏前,先-20℃預(yù)凍,再放入-80保藏;取出使用時,逐級融化后使用。
實(shí)際使用時,甘油管直接-80冷凍保藏,使用時取出來直接用手捂熱使用,也是符合第一種說法的。
效果到底哪種方式好,還需要繼續(xù)研究,等待進(jìn)一步數(shù)據(jù)。

(三)穿刺保藏法和活化

1.穿刺保藏法操作步驟

穿刺保藏法原理是缺氧和低溫,即菌種保存在半固體培養(yǎng)基內(nèi)部,造成缺氧環(huán)境,然后保存于4℃,延長菌種時間。

(1)制備半固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基跟固體培養(yǎng)基的區(qū)別在于瓊脂粉含量不同,前者瓊脂粉含量1%,后者含量1.5%-2%。
半固體培養(yǎng)基添加至無菌試管約1/3處,營養(yǎng)不宜太豐富。
值得注意的是,半固體培養(yǎng)基配制好后需要豎起來,不需要擺斜面。

(2)接種

用接種針挑取少量細(xì)菌,從半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入,直至接近半固體培養(yǎng)基1/2處自上而下穿刺,不要穿透,然后沿原穿刺線將接種針退出,穿入培養(yǎng)基若干次,放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待微生物生長良好后,用2毫米無菌液體石蠟覆蓋,以創(chuàng)造缺氧環(huán)境并4℃保藏。
(3)保藏時間
一般3-6月后轉(zhuǎn)種。
有的菌種保存時間至少可以達(dá)到1 年,有的菌種甚至能達(dá)到20 年之久。
(4)適用對象
適用于工程大腸桿菌等細(xì)菌,操作簡便,保存時間較長。
(5)優(yōu)點(diǎn)
操作簡便,保存時間比斜面保藏法長。

(6)缺點(diǎn)

比較耗費(fèi)空間,不便于攜帶。

2.穿刺保藏菌種活化

用接種環(huán)沿著菌種方向穿入,挑取菌種,轉(zhuǎn)接至斜面上或平板培養(yǎng)基上,或加入無菌水搖晃,稀釋涂布即可。

(四)液體石蠟保藏法

液體石蠟保藏法實(shí)際上是斜面保藏法的一種改進(jìn)形式。它的原理基于斜面保藏菌的基礎(chǔ)上,覆蓋一層液體石蠟,創(chuàng)造缺氧環(huán)境而保存于4℃。
1.液體石蠟保藏法
(1)準(zhǔn)備液體石蠟
根據(jù)需要,將液體石蠟進(jìn)行分裝密封,放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min,滅菌完成后放置于40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分,約4天,或105℃烘箱中1h,待水分蒸發(fā)完全后,備用。
(2)制備斜面菌種
(3)封液體石蠟
將無菌干燥的液體石蠟注入上述培養(yǎng)好的斜面上,加入石蠟的量以高于斜面頂端1cm為宜,再將試管密封,直立于4℃左右冷藏保存。
覆蓋滅菌的液體石蠟,一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡,另一方面可阻止氧氣進(jìn)入,以減弱代謝作用。要定期添加石蠟保證斜面處于液面以下。

(4)保藏時間

保藏時間至少可以達(dá)到1年,甚至更長。

一般情況,不產(chǎn)芽孢細(xì)菌保藏1年,芽孢菌、放線菌、霉菌可保藏2年,酵母菌可保藏1-2年。

(5)對象
細(xì)菌,酵母菌,放線菌等。
(6)優(yōu)點(diǎn)
保藏時間較斜面保藏法長,操作簡便。
(7)缺點(diǎn)
需要直立放置,比較耗費(fèi)空間,不便于攜帶。
2.液體石蠟保藏菌種活化
將保藏的斜面取出來,用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種,適當(dāng)在試管內(nèi)壁輕點(diǎn)幾下,減少石蠟量,然后采用劃線法接種于新鮮平板上培養(yǎng),待生長良好,再次傳代,培養(yǎng)。
3.注意事項(xiàng)
(1)液體石蠟易燃,必須注意火災(zāi)。
(2)移植菌種時,接種針上帶有石蠟和菌體,火焰滅菌時易飛賤、爆發(fā),嚴(yán)防感染。
(3)由于取出的菌種帶有一定量的液體石蠟,生長較慢且有粘性,因此,需要傳代2次。

(五)沙土管保藏法

沙土管干燥保藏法的原理是在沙土干燥條件下微生物細(xì)胞代謝活動減緩,繁殖速度受到抑制,這樣減少菌株突變,延長菌株存活時間。將培養(yǎng)好的菌種與無菌沙土混合,使菌體吸附在沙土載體上,干燥后保存。

1.沙土管保藏法

(1)處理沙土

將沙和土洗凈、烘干、過40目篩子,將沙與土以2:1的比例混合、分裝(每管1g沙土),滅菌,烘干。

(2)制備孢子懸液
當(dāng)孢子成熟后,用無菌水洗下制成孢子懸液,備用

(3)抽干、封口

將孢子懸液加入無菌的沙土管中,每管0.5mL,通過減壓干燥的方式去除沙土管中水分,直至水分被抽干,最后用石蠟或橡膠塞封口。

沙土管主要是通過創(chuàng)造干燥和寡營養(yǎng)的條件來保藏菌種。操作的時候應(yīng)該注意抽干一步務(wù)必要快,盡量在12h內(nèi)完成,防止孢子萌發(fā),降低保藏效果。
(4)保藏時間
兩年左右,根據(jù)菌種特性,保藏時間可能更長。
(5)適用對象
適用于能產(chǎn)生孢子的微生物,如霉菌、放線菌,能形成芽孢的芽孢桿菌也可以采用該方法。
(6)優(yōu)點(diǎn)
保藏效果好,適用性也較廣泛,在抗生素生產(chǎn)工廠應(yīng)用廣泛。
(7)缺點(diǎn)
不能保藏營養(yǎng)細(xì)胞。
2.沙土管保藏菌種活化
取出少量沙土顆粒,放入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),或在固體培養(yǎng)基表面涂抹后培養(yǎng)。
3.注意事項(xiàng)
(1)需選擇適合的沙土材料,排水性好、顆粒細(xì)小均勻、無害菌和病原菌,并且不含明顯異味。

(2)嚴(yán)格消毒和無菌操作。

(六)冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法的原理是將菌種冷凍,在減壓下利用升華作用去除水分,使細(xì)胞的生理活動趨于停止,從而使菌種長期維持存活的狀態(tài)。

1.冷凍真空干燥保藏法

(1)制備菌懸液

將處于成熟期的微生物培養(yǎng)物懸浮于無菌的脫脂奶粉或者海藻糖等保護(hù)劑中制成濃菌液,裝到無菌的安瓿瓶中。
(2)抽真空,干燥
將上述安瓿瓶放置于低溫冰箱中冷凍,達(dá)到預(yù)定溫度后對濃菌液進(jìn)行冷凍干燥處理,之后在真空狀態(tài)下融封安瓿瓶,于20℃保藏。
(3)保藏時間
五到十年,因保藏期較長,一定要標(biāo)記清楚,以免遺忘。
(4)適用對象
適用于大批量菌種的長期保存。該保藏法是目前適用范圍最廣,保藏效果最好的方法,如果需要長期保藏就選擇這種方法。
(5)優(yōu)點(diǎn)
適用范圍廣,保藏效果好,存活率高,變異小,便于攜帶。
(6)缺點(diǎn)
因涉及到冷凍抽真空設(shè)備,一般實(shí)驗(yàn)室不具備條件,需要到專門保藏機(jī)構(gòu)保藏,成本增加。
2.冷凍真空干燥保藏菌種活化
(1)安瓿瓶開封

先用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管,用酒精燈火焰將安瓿管頂端適度加熱,然后用移液器取少量無菌水,將無菌水滴至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂,最后用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

(2)復(fù)活方法
先用移液器吸取0.3-0.5mL適宜的液體培養(yǎng)基,滴人安瓿管內(nèi),輕輕振蕩,使菌體溶解呈懸浮狀,然后取0.1-0.2mL菌體懸浮液,移植于適宜的斜面或平板培養(yǎng)基上,剩余的菌液,注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),適宜的溫度下培養(yǎng)。

(七)液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏法主要是利用微生物在低于-130°C的低溫下新陳代謝趨于停止的原理,在液氮中(-196°C的超低溫下)有效地進(jìn)行菌種保藏的方法。

1.液氮超低溫保藏法操作步驟
(1)制備菌懸液
離心收集對數(shù)生長期微生物細(xì)胞,用新鮮的培養(yǎng)基重懸微生物細(xì)胞。
(2)添加保護(hù)劑
一般使用20%甘油和上述菌懸液等體積混勻,加入無菌的安瓿瓶中。
(3)冷藏
將上述安瓿瓶緩慢預(yù)冷,最后移至液氮罐中的液相(-196℃)或氣象相(-156℃)作長期超低溫保藏。
(4)對象
所有微生物。
(5)保藏時間
15年以上或更長。
(6)優(yōu)點(diǎn)
適用性廣,幾乎適用于所有微生物,保藏期長。
(7)缺點(diǎn)
需要液氮罐等特殊設(shè)備,且管理費(fèi)用高、操作較復(fù)雜、攜帶不便。

四、菌種保藏共同點(diǎn)

1.嚴(yán)格無菌操作。
2.所保藏的微生物在保藏時處于良好的狀態(tài)。
3.防止退化的發(fā)生。所以,保藏期一到,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)接重新保種。

總之,菌種保藏是微生物學(xué)的重中之重,根據(jù)微生物的習(xí)性和使用時間,選擇合適的保藏方法。


編輯:songjiajie2010

 
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