1.1 食品檢樣

巴氏消毒牛奶、原味面包

1.2 儀器

全自動(dòng)菌落分析儀

立式壓力蒸汽滅菌器

生化培養(yǎng)箱

均質(zhì)機(jī)

恒溫水浴鍋

培養(yǎng)皿（直徑90mm）

1.3 試劑

瓊脂

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）

氯代三苯基四氮唑（TTC）

首先將購(gòu)買的巴氏消毒牛奶和面包放置使它們過期，牛奶過期 8h，面包過期96h，通過過期處理有助于菌落蔓延的形成。整個(gè)檢驗(yàn)步驟按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》（以下簡(jiǎn)稱國(guó)標(biāo)）進(jìn)行。每種樣品做10^-2、10^-3、10^-4，3個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度每組做12個(gè)檢驗(yàn)平板、2個(gè)空白平板。

2.1 對(duì)照組

按照國(guó)標(biāo)正常檢測(cè)，制成檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板后培養(yǎng)基不加覆蓋。

2.2 加覆蓋組

按照國(guó)標(biāo)法制作檢驗(yàn)平板后，加入 5 mL 滅菌培養(yǎng)基覆蓋住原培養(yǎng)基。采用兩種不同的覆蓋方案，加覆蓋組一是檢驗(yàn)平板做好后，加入的覆蓋培養(yǎng)基的瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%（配方：瓊脂 20g，水 98g），加覆蓋組二瓊脂含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%（配方：瓊脂40g，水960g）。

2.3 加濾紙組

培養(yǎng)皿滅菌前在培養(yǎng)皿皿蓋中放置兩層濾紙，目的是在菌落總數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)的過程中可以吸收一定量的冷凝水，防止微生物細(xì)胞或孢子隨著冷凝水遷移，減少菌落蔓延的發(fā)生，然后按照國(guó)標(biāo)法制作不加覆蓋的平板。

2.4 加 TTC 組

每 100 mLPCA 培養(yǎng)基中加人0.1%TTC溶液2.5mL混勻，按照國(guó)標(biāo)法制作不加覆蓋的平板。TTC 染色液能夠使菌落呈現(xiàn)紅色而培養(yǎng)基和食品殘?jiān)�顆粒不會(huì)被染色，有利于菌落計(jì)數(shù)時(shí)真實(shí)菌落的鑒別，且不會(huì)對(duì)微生物特別是細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖造成影響。

將制成的平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃培養(yǎng) 48 h。首先計(jì)數(shù)不同組別、不同稀釋度檢驗(yàn)平板菌落蔓延情況，然后使用全自動(dòng)菌落分析儀計(jì)數(shù)不同稀釋度不蔓延平板的微生物菌落數(shù)量，空白平板均無菌落生長(zhǎng)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)過期牛奶的菌落蔓延情況、過期面包菌落蔓延情況和過期牛奶面包的菌落總數(shù)檢驗(yàn)情況，制成表1~表3。

3.1 過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓 延情況統(tǒng)計(jì)

過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)見表 1。

3.2 過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)

過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)見表 2。

3.3 菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果見表 3。

從以上3.1過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)表和3.2過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)表中可以看出不經(jīng)過處理的對(duì)照組平板，菌落蔓延非常嚴(yán)重，巴氏消毒牛奶和面包分別達(dá)到了77.8%、94.4%；加TTC組菌落蔓延也很嚴(yán)重，均達(dá)到了75.0%，與對(duì)照組相比有所改善；加濾紙組菌落蔓延分別達(dá)到了69.4%和75.0%，菌落蔓延對(duì)檢驗(yàn)的影響也較大；加覆蓋組一菌落蔓延分別達(dá)到了38.9%、44.4%，對(duì)菌落蔓延有較好的抑制作用，可以保證檢驗(yàn)得到結(jié)果；加覆蓋組二菌落蔓延分別達(dá)到了25.0%、27.8%，菌落蔓延的到了較好的控制，是防止菌落蔓延所有試驗(yàn)方法中最佳的。

對(duì) 3.3 菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果分析：以過期巴氏消毒牛奶為例：對(duì)照組、加 TTC組、加濾紙組、加覆蓋組一、加覆蓋組二平均菌落數(shù)分別為91000、91000、87000、89000、80000 CFU/mL，各組得到的數(shù)據(jù)相差不大，對(duì)食品檢驗(yàn)的最后報(bào)告不會(huì)造成實(shí)際的影響，說明檢驗(yàn)過程中通過一定的方法防止菌落蔓延對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響較小，可以在實(shí)際工作中采用。分析過期面包的檢驗(yàn)結(jié)果可以得到同樣的結(jié)論。

控制菌落蔓延在食品微生物檢測(cè)中非常重要，面包、饅頭、蛋糕、米粉、餅干等多種食品在檢驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)菌落蔓延情況，其他食品的檢驗(yàn)也會(huì)或多或少出現(xiàn)，對(duì)檢驗(yàn)工作造成困擾。加覆蓋組二對(duì)菌落蔓延的抑制作用很明顯，相比對(duì)照組平均下降52.8%和66.6%；加覆蓋組一的效果也不錯(cuò)，相比對(duì)照組平均下降38.9%和50.0%。

同一種食品采用不同的配方、加工工藝、不同的溫度對(duì)微生物的影響不同，檢測(cè)的結(jié)果也有不同。本次研究的食品試驗(yàn)材料只有2種，相對(duì)較少；同時(shí)受到配置稀釋液時(shí)間等限制，不可能一次做大量平板，對(duì)研究結(jié)果造成一定影響，結(jié)論僅供參考。