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GB 4789.40-2024《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾檢驗》為上述標準之一。標準于2024年2月8日發(fā)布，將于2024年8月8日正式實施。
本文通過對比克羅諾桿菌檢驗2024版與2016版標準，使讀者更好地了解2024版修訂的變更，以便更好地掌握克羅諾檢驗的發(fā)展方向。
一、簡要說明
本標準與GB4789.40-2016相比主要變化如下：
--修改了標準名稱，刪除了阪崎腸桿菌，修改為“食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌檢驗”。
--標準適用范圍增加了嬰幼兒輔助食品;
--增加了PCR鑒定方法作為選做內(nèi)容;
--刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產(chǎn)黃色素和苦杏仁苷項目;
--修改了培養(yǎng)基和試劑pH調(diào)節(jié)方法;
--修改了預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間;
--修改了生化反應的培養(yǎng)溫度及氨基酸培養(yǎng)基的制備。
二、變化詳情
本標準規(guī)定了食品中克羅諾桿菌(Cronobacterspp)的檢驗方法。
本標準適用于嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗。
增加嬰幼兒輔助食品
2016版
2024版
1.刪除25度恒溫培養(yǎng)箱；恒溫水浴溫度范圍調(diào)整，由原來的44℃±0.5℃調(diào)整為41.5℃±1℃；
2.增加0.01感量的天平；無菌錐形瓶修改為無菌容器；
3.增加PCR檢測方法的所用到的PCR儀、離心機、電泳儀、反應管、離心管、接種環(huán)等設備和材料。
2024版
2016版
1.阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基變更為“克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基”與標準名稱對應；
2.增加PCR檢測方法的培養(yǎng)基和試劑
2016版
2024版
1.ST-Vm增菌液培養(yǎng)溫度變更為“41.5℃±1℃”；
2.修改了預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間
3.增加PCR鑒定（選做），可節(jié)省檢測時間
5.1 前增菌和選擇性增菌
取檢樣 100g(mL)置于無菌容器中,加入900mL已預熱至 41℃±1℃的 BPW,用手緩緩地搖動至檢樣充分溶解后,36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。輕輕搖動混勻培養(yǎng)過的前增菌液,移取1mL轉入10mLmLST-Vm肉湯中,41.5℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
1.無菌錐形瓶改為“無菌容器”；
2.為避免溫度較高損傷細菌，前增菌BPW的預熱溫度由44℃修改為41 ℃。
3.44℃的選擇性增菌溫度可能抑制部分損傷的克羅諾桿菌生長，容易導致污染樣品被漏檢。ISO22964-2017標準已對選擇性增菌溫度由 44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃。且在制定標準過程中的驗證試驗結果也顯示，mLST-Vm肉湯經(jīng)41.5 ℃培養(yǎng)后檢測結果優(yōu)于44 ℃。因此，GB4789.40新版標準中選擇性增菌溫度修改為41.5 ℃±1 ℃。
5.2 分離
5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物,使用10μL接種環(huán)各取1環(huán)增菌培養(yǎng)物,分別劃線接種于2個克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,或按培養(yǎng)基要求條件培養(yǎng)。
5.2.2 可疑菌落按顯色培養(yǎng)基要求進行判定,每個平板挑取至少 5個可疑菌落(不足5個時挑取全部可疑菌落) ,分別劃線接種于TSA平板,36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
1.分離用的接種環(huán)指出其為10μL的，更明確；
2.顯色培養(yǎng)基的名稱前后對應起來，刪除了“顯色培養(yǎng)基須符合GB4789.28的要求”，個人覺得這是個漏點。
3.修改了TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間，由原來的25℃±1℃，培養(yǎng)48h±4h修改為“36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h”。
3.增加PCR鑒定方法：隨著微生物檢驗對快速方法的檢測需求， GB標準中引入PCR法，即可節(jié)省檢測時間，減少工作量，又可以提高結果的準確性，實現(xiàn)對可疑菌落高通量的篩選。
5.4 確證試驗
選做5.3時,自PCR結果陽性的TSA平板上挑取菌落進行生化鑒定, PCR結果陰性的TSA平板不再進行生化鑒定。
未選做 5.3時 ,直接將 5.2.2的可疑菌落接種TSA平板后進行生化鑒定。
可以首先鑒定克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上最具特征性的菌落接種的TSA平板上的菌落。如果是陽性,則不需要測試其他TSA平板上的菌落。如果是陰性,則選取其他TSA平板上的菌落進行鑒定,直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽性菌落為止。為確保結果的準確性,對TSA平板上的菌落進行鑒定時,應使用新鮮的傳代菌落。克羅諾桿菌的主要生化特征見表3。
上述鑒定也可選擇商生化特征見表3。上述鑒定也可選擇商品化生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)進行 。
1.步驟名稱由鑒定修改為“確證試驗”；
2.刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產(chǎn)黃色素項目，因為在文獻報道和實際檢測中發(fā)現(xiàn)部分克羅諾桿菌不產(chǎn)黃色素，因此在新版標準中刪除了該步驟及生化鑒定中產(chǎn)黃色素項目的操作；
3.刪除苦杏仁苷生化反應；
4.強調(diào)做生化實驗的菌落一定要新鮮培養(yǎng)物，如果為陰性，需要繼續(xù)則選取其他TSA平板上的菌落進行鑒定,直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽性菌落為止。
6 結果與報告
根據(jù)菌落特征、確證試驗(生化鑒定)和/或PCR鑒定結果,報告 100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。
1.修改了文字描述；
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
取檢樣100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份,分別置無菌容器中,分別加入900mL、90mL、9mL已預熱至41℃±1℃的BPW,用手緩緩地搖動至檢樣充分溶解,制成1:10樣品勻液,36 ℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。輕輕搖動混勻培養(yǎng)過的前增菌液,分別移入1mL轉入10mLmLST-Vm肉湯,41.5℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。
1.修改了檢測方法的名稱；
2.同第一法一樣修改前增菌、增菌的培養(yǎng)溫度；
3.修改可了樣品處理的描述分固體和半固體、液體放在一起更簡潔。
7.2 分離、鑒定
同5.2、5.3和5.4。
8 結果與報告
綜合菌落特征、確證試驗(生化鑒定)或 PCR鑒定結果,根據(jù)檢出克羅諾桿菌的陽性管數(shù),查MPN檢索表,報告100g(mL)樣品中克羅諾桿菌的MPN值(見附錄C中表 C.1) 。
1.修改了培養(yǎng)基和試劑pH值調(diào)節(jié)方法，要求pH值滅菌后測定；
2.修改了相應的培養(yǎng)基名稱及增加PCR檢測用的試劑配制方法。
3.修改了氨基酸培養(yǎng)基的制備。
