一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
(1)儀器:凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱
(2)玻璃器皿:吸管(彎頭、直頭)、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、廢液缸
(3)塑料器皿:吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(1~2ml)
(4)其他物品:微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍
(5)試劑:PBS、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶(0.08%)
二、操作步驟
(1)從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
(2)從37℃水浴中取出凍存管,75%酒精消毒后,打開蓋子,用吸管吸出細(xì)胞懸液,加到離心管中。PriCells推薦接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
(3)離心,1000rpm,5min。PriCells推薦不離心。
(4)棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。PriCells推薦小牛血清濃度依據(jù)原代細(xì)胞種類。
(5)次日更換一次1/2培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項(xiàng)
(1)將凍存管從液氮容器中取出時(shí),要做好防護(hù)工作,以免凍傷。
(2)取出凍存管后立即放入水浴中,使其盡快融化(在1-2分鐘內(nèi))。
(3)復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。