測定生長量的方法有許多種,可以直接測量培養(yǎng)物的體積或質(zhì)量,也可以通過測量細(xì)胞組分含量或濁度等指標(biāo)來間接獲得微生物的量。
(一)直接法
1.測體積
它是一種較為粗放的方法,通常用于初步的測定。
操作方法如下:將待測培養(yǎng)液放在刻度離心管中作自然沉降或進(jìn)行一定時間的離心,然后觀察沉降物的體積。
2.稱干重
采用離心法或過濾法測定,一般干重為濕重的10%-20%,一個細(xì)菌一般重10-12
~10-13g。
離心法:將待測培養(yǎng)液離心,再用清水洗滌離心1~5次后干燥,可用105℃、100℃或紅外線烘干,也可在較低的溫度(-80℃或-40℃)下進(jìn)行真空干燥,然后稱干重。
過濾法:如為絲狀真菌可用濾紙過濾,如為細(xì)菌可用乙酸纖維膜等濾膜進(jìn)行過濾。過濾后,細(xì)胞可用少量水洗滌,再真空干燥(-40℃以下),稱干重。一般在液體培養(yǎng)基中,細(xì)菌的濃度的數(shù)量級大約為108CFU/mL, 100 mL培養(yǎng)物可獲得10 mg ~300 mg干重的細(xì)菌。
(二)間接法
1.代謝指標(biāo)法
微生物生長過程中伴隨著的物質(zhì)合成與利用,因此很多代謝指標(biāo)與細(xì)菌生長量相關(guān),這些指標(biāo)可用作生長測定的相對值。
大多數(shù)細(xì)菌的含氮量約為干重的12.5% ,酵母菌約為7.5% ,霉菌約為6.0%.總氮在細(xì)胞粗蛋白中的含量也較為穩(wěn)定。因此,培養(yǎng)物含氮量可以近似反應(yīng)生長量。含氮量的測定方法有很多,常用凱氏定氮法。此法適用于細(xì)胞濃度較高的樣品,操作過程較繁鎖。
微生物新陳代謝過程中離不開碳元素。測定培養(yǎng)物含碳量的方法如下:將培養(yǎng)物混入1ml水或無機(jī)緩沖液中,用2 mL2%重鉻酸鉀溶液在100 ℃下加熱30 min,冷卻后,加水稀釋至5 mL,在580 nm波長下測定光密度值(用試劑作空白對照,并用標(biāo)準(zhǔn)樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線),即可推算出生長量。
微生物細(xì)胞內(nèi)的其他成分,如磷、DNA、RNA、ATP和N-乙酰胞壁酸等的含量,以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)二氧化碳(用標(biāo)記葡萄糖作基質(zhì))、耗氧、黏度和產(chǎn)熱等指標(biāo),也都可以用于生長量的測定。
2.比濁法
微生物在液體培養(yǎng)基中生長,由于個體體積和細(xì)胞數(shù)量的增加,引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過測定培養(yǎng)物的濁度可以近似推斷其生長量。
比濁法通常采用McFarland比濁管,用不同濃度的氯化鋇與稀硫酸配制成的10支試管,其中形成的硫酸鋇有10個濃度梯度,分別對應(yīng)10個相對的細(xì)菌濃度(預(yù)先用相應(yīng)的細(xì)菌測定)。某一未知濃度的菌液在透射光下用肉眼與某一比濁管進(jìn)行比較,如果兩者的濁度相當(dāng),即可目測出該菌液的大致濃度。如要精確測定培養(yǎng)物的濁度,則需要用分光光度計進(jìn)行。在可見光的450 nm -650 nm波長內(nèi)均可測定。