從混雜微生物群獲得純培養(yǎng)物對(duì)微生物學(xué)研究至關(guān)重要。

純培養(yǎng)物是指來(lái)源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群體。

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

平板涂布法

因?yàn)閷⑽⑸�物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

用途：一般多用于從菌種的純化；

優(yōu)點(diǎn)：可以觀(guān)察菌落特征，對(duì)混合菌進(jìn)行分離；

缺點(diǎn)：不能計(jì)數(shù)；

平板劃線(xiàn)法

最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法，其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線(xiàn)”稀釋而達(dá)到分離目的的。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。

用途：一般多用于篩選菌株。一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計(jì)數(shù)。 

優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀(guān)察菌落特征。 

缺點(diǎn)：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的話(huà)，長(zhǎng)不出單菌落。

大腸菌群能在乳糖膽鹽液體培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，并且產(chǎn)氣產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液變色。還能在伊紅美蘭固體培養(yǎng)上生長(zhǎng)，形成黑紫色的菌落，有的還有金屬光澤。其他病原菌的菌落呈粉紅色。再做鏡檢觀(guān)察是無(wú)芽孢的革蘭氏陰性桿菌（呈紅色）。即可鑒定是有大腸菌群的菌存在。

菌種保藏是將微生物的菌種經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的保存，不污染其它雜菌，及可保持其形態(tài)特征和生理性狀，減少變異，防止衰老，以便于將來(lái)使用。保藏菌種一般是選用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)低溫；干燥；缺氧；避光和缺少營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件，以利于休眠體能長(zhǎng)期地處于休眠狀態(tài)。對(duì)于不產(chǎn)孢子的微生物，應(yīng)使其新陳代謝處于最低狀態(tài)，又不會(huì)死亡，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。

注：

1.乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液態(tài)、鑒別、增值、半合成培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)中用于廢水中菌群的培養(yǎng)；

2.伊紅美藍(lán)瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍(lán)和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，特別是大腸菌群和糞大腸菌群；

3.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化后的菌體培養(yǎng)。

1.實(shí)驗(yàn)安排

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；

采樣、恒溫培養(yǎng)富集及初篩；

觀(guān)察產(chǎn)氣情況及稀釋、倒培養(yǎng)基、劃線(xiàn)、涂布、倒置培養(yǎng)；

鑒定、接種；

菌種保藏。

2.具體操作步驟

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

①配置培養(yǎng)基(伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基：7.4g+200mL無(wú)菌水、調(diào)pH7.2～7.4，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：6.6g+200mL無(wú)菌水、調(diào)pH7.4±0.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基2.6g+100mL無(wú)菌水，調(diào)pH7.4±0.2),，裝瓶，高壓蒸汽滅菌。

②包扎好培養(yǎng)皿，移液管，試管，進(jìn)行干熱滅菌。

③將配好的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基分裝入三個(gè)試管中，每個(gè)大約十毫升，包扎，滅菌。

④液體石蠟和涂布棒等其他實(shí)驗(yàn)玻璃器進(jìn)行滅菌。

 采樣、培養(yǎng)

取水，湖水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基試管中，貼好標(biāo)簽（采樣時(shí)間、人物、溫度，采樣地點(diǎn)及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養(yǎng)18～24小時(shí)；

觀(guān)察產(chǎn)氣情況、稀釋

①觀(guān)察產(chǎn)氣管有無(wú)氣柱，標(biāo)記陽(yáng)性管數(shù)。

②樣品稀釋?zhuān)?/span>

對(duì)已滅菌的5只試管編號(hào)（分別為1、2、3、4、5號(hào)），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號(hào)試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標(biāo)簽。

劃線(xiàn)、涂布

①涂布平板法：

將已熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。

※涂布平板法操作：

1.取少量菌液（不超過(guò)0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面；

2.用滅菌過(guò)的涂布棒或一次性涂布棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。

注意：

1.將涂布器末端浸在盛有體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精的燒杯中。取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2.操作中一定要注意防火！不要將過(guò)熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）

②平板劃線(xiàn)法：

經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許菌落，在無(wú)菌伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線(xiàn)，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線(xiàn)次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線(xiàn)適宜的話(huà)，微生物能一一分散。在37℃經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后，可在平板表面得到單菌落。（有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。）

平板劃線(xiàn)操作：

鑒定

觀(guān)察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀(guān)察是否為無(wú)芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。

培養(yǎng)

a.將菌落轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的滅菌錐形瓶中調(diào)節(jié)酸堿度為7，充分搖勻備用。

b.液體發(fā)酵：取處理好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中。搖勻后置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)

菌種保藏

①斜面低溫保藏法：

此法為最常用的一種。一般霉菌；放線(xiàn)菌和有芽孢的細(xì)菌可保存2～4個(gè)月，酵母菌可保存2個(gè)月，無(wú)芽孢的細(xì)菌最好每周移接一次。操作過(guò)程如下：

a.接種：將要保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基上，試管上貼好標(biāo)簽，寫(xiě)上菌種名稱(chēng)，時(shí)間。

b.培養(yǎng)：各類(lèi)菌按其所需溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。

c.保藏：選取生長(zhǎng)健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4℃冰箱中保藏。

②液體石臘保藏法：

此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時(shí)間是半年至一年。放線(xiàn)菌；霉菌和產(chǎn)芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，而引起的菌種死亡。同時(shí)可阻止氧氣進(jìn)入，防止好氧菌的生長(zhǎng)。從而延長(zhǎng)菌種保藏的時(shí)間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過(guò)程如下

a液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌二次（120℃30分鐘）。再在110～120℃干燥箱中蒸發(fā)掉蒸汽滅菌時(shí)帶入的水分。此時(shí)石臘透明清亮狀。經(jīng)檢驗(yàn)確定無(wú)菌后備用。

b菌種培養(yǎng)：將所需的菌種經(jīng)培養(yǎng)后，選取健狀的保藏。

c加石臘油：用無(wú)菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點(diǎn)1cm為宜。少了會(huì)因培養(yǎng)基露出油面，而使培養(yǎng)基變干造成菌死亡。

d 收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

e 恢復(fù)使用：當(dāng)要使用菌種時(shí)。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復(fù)使用。接種培養(yǎng)。由于菌體外粘有油。第一次的菌生長(zhǎng)緩慢，性狀恢復(fù)不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌種。

1．觀(guān)察記錄乳糖膽鹽培養(yǎng)基產(chǎn)氣情況。

2．觀(guān)察EMB培養(yǎng)基上菌落（包括：形態(tài)，質(zhì)地，色澤，上述實(shí)驗(yàn)方案中有具體說(shuō)明。）

3．記錄鏡檢結(jié)果。