于同一批號(hào)的三個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取12個(gè)最小銷售包裝樣品，1/4樣品用于檢測，1/4樣品用于留樣．另1/2樣品（可就地封存）必要時(shí)用千復(fù)檢。抽樣的最小銷售包裝不應(yīng)有破裂，檢驗(yàn)前不得啟開。

在100級(jí)凈化條件下用無菌方法打開用千檢測的至少3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10g土1g樣品。剪碎后加人到200mL滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí)，稀釋液量可按每次50mL遞增．直至能吸出足夠測試用樣液。在計(jì)算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時(shí)相應(yīng)調(diào)整稀釋度。

本方法適用于產(chǎn)品初始污染菌與細(xì)菌菌落總數(shù)（以下統(tǒng)稱為細(xì)菌菌落總數(shù)）檢測。

1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計(jì)數(shù)。共接種5個(gè)平皿．每個(gè)平皿中加入1mL樣液．然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20mL倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿35℃士2℃培養(yǎng)48h后，計(jì)算平板上的菌落數(shù)。

2 菌落總數(shù)計(jì)算

X1--細(xì)菌菌落總數(shù)CFU/g或CFU/mL

A--營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌菌落總數(shù)；

K--稀釋度。

當(dāng)菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)采用二位有效數(shù)字。

如果樣品菌落總數(shù)超過本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，按B2.3進(jìn)行復(fù)檢和結(jié)果報(bào)告。

3 復(fù)檢方法

將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測2次，2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何1次結(jié)果平均值超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。

1 操作步驟

取樣液5mL接種50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃士2℃培養(yǎng)24比如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為大腸菌群陰性。

如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃士2℃培養(yǎng)18~24h，觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸菌群為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落．

取疑似菌落1~2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置35℃士2℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。

2 結(jié)果報(bào)告

凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣．乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性，可報(bào)告被檢樣品檢出大腸桿菌。

1 操作步驟

取樣液5ml,加人到50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃士2℃培養(yǎng)18~24h如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六炾三甲基漠化欽瓊脂平板，置35℃士2℃培養(yǎng)18~24h，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不長。

取可疑菌落涂片作革蘭氏染色．鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：

氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、42℃生長試驗(yàn)

綠膿菌素試驗(yàn)：取2~3個(gè)可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面，35℃士2℃培養(yǎng)24h,加人三氯甲燒3~5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三氯甲燒呈藍(lán)色時(shí)，用吸管移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

2 結(jié)果報(bào)告

氧化酶及綠膿桿菌試驗(yàn)均為陽性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。

如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。

1 操作步驟

取樣液5mL．加人到50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃士2℃培養(yǎng)24h。

自上述增菌液中取1~2接種環(huán)，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃士2℃培養(yǎng)24~48h在血瓊脂平板上該菌落呈金黃色．大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。

挑取典型菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：

甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液，置35℃士2℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽性。

血漿凝固酶試驗(yàn)：玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿．挑取菌洛分別與生理鹽水和血漿混合，5min如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無 凝固則為陽性，如兩者均無凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象，再進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn)；

試管法：吸取1:4新鮮血漿0.5ml，放滅菌小試管中，加人等量待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL。混勻，放35℃士2℃溫箱或水浴中．每半小時(shí)觀察一次．24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物各0.5mL作為陽性與陰性對照。

2 結(jié)果報(bào)告

凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

1 操作步驟

取樣液5mL加入到50mL葡萄糖肉湯，35℃士2℃培養(yǎng)24h。

將培養(yǎng)物劃線接種血瓊脂平板，35℃士2℃培養(yǎng)24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰白色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明溶血圈。

挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陽性，呈鏈狀排列的球菌．鏡檢符合上述情況，應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：

鏈激酶試驗(yàn)：吸取草酸鉀血漿0.2rnL(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀．吸取上清液），加人0,8mL滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25ml，混勻放35℃士2℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時(shí)間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h觀察，如凝塊全部溶化為陽性，24h仍不溶化為陰性。

桿菌膚敏感試驗(yàn)：將被檢菌菌液涂布血平板上，用滅菌攝子取每片含0.04單位桿菌膚的紙片放在平板表面上，同時(shí)以已知陽性菌株作對照，在35℃士2℃下放置18~24h，有抑菌帶者為陽性。

2 結(jié)果報(bào)告

鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌，血平板上呈現(xiàn)溶血圈鏈激酶和桿菌肽試驗(yàn)陽性．可報(bào)告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作真菌計(jì)數(shù)。共接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入1mL樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基15~25mL倒人每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置25℃士2℃培養(yǎng)7天，分別于3、5、7天觀察，計(jì)算平板上的菌落數(shù)，如果發(fā)現(xiàn)菌落蔓延，以前一次的菌落計(jì)數(shù)為準(zhǔn)．

2 結(jié)果報(bào)告

X2--真菌菌落總數(shù)，CFU/g或CFU/mL；

B--5塊沙氏瓊脂培養(yǎng)基平板上的真菌菌落總數(shù)；

K--稀釋度。

當(dāng)菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)采用二位有效數(shù)字。

如果樣品菌落總數(shù)超過本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，進(jìn)行復(fù)檢和結(jié)果報(bào)告。

3 復(fù)檢方法

將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測2次，2次結(jié)果都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何1次結(jié)果超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。

1 操作步驟

取樣液5mL加人到50mL沙氏培養(yǎng)基中、25℃士2℃培養(yǎng)7天，逐日觀察有無真菌生長。

2 結(jié)果報(bào)告

培養(yǎng)管混濁應(yīng)轉(zhuǎn)種沙氏瓊脂培養(yǎng)基，證實(shí)有真菌生長，可報(bào)告被檢樣品檢出真菌。