亞硫酸氫鈉修飾DNA的目的是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不變。影響此過程的主要因素有修飾試劑的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)環(huán)境的pH值及反應(yīng)時間。其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都將導(dǎo)致MSP擴增失敗，體會如下：

(1)亞硫酸氫鈉的濃度最好控制在3.0-3.9mol/L為好，其pH值必須用NaOH精確調(diào)整至5.0；

(2)修飾時間應(yīng)掌握在10-16h，修飾時間過長會導(dǎo)致甲基化胞嘧啶也會轉(zhuǎn)化成尿嘧啶且DNA模板破壞加劇，而時間過短會導(dǎo)致修飾不徹底；

(3)反應(yīng)溫度應(yīng)控制在50-55℃(若用國產(chǎn)恒溫水浴箱建議溫度設(shè)定在53℃為好)；

(4)DNA模板量應(yīng)控制在<2ug為宜。

只要遵循以上幾點基本上能保證99%未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。但是，此修飾過程中模板DNA有約96%已經(jīng)降解 .當(dāng)DNA樣品較少時(如石蠟包埋組織、血清DNA)，在純化回收時可加人適量鮭魚精DNA或糖原(約1g)作為載體，有利于DNA沉淀(加入載體后輕輕晃動Eppendof管可見絮狀DNA富集現(xiàn)象)。

甲基化特異PCR可能出現(xiàn)的問題與對策

1.引物因素分析MSP的引物設(shè)計的質(zhì)量是擴增成敗的關(guān)鍵性因素。

MSP的引物設(shè)計與普通的PCR引物設(shè)計不同，MSP的引物設(shè)計原理是：模板DNA在經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，發(fā)生甲基化的基因啟動子區(qū)域CpG島內(nèi)CpG位點5-端胞嘧啶保持不變；而未發(fā)生甲基化的CpG島內(nèi)CpG位點5-端胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，即C-U。針對修飾前后的序列差異用MethPrimer軟件設(shè)計甲基化與未甲基引物，進行PCR擴增。MSP的引物序列中至少含有1個以上CpG位點，最好是含有多個CpG位點，這樣可保證引物的特異性，同時可以提高DNA啟動子甲基化堿基的檢出率。MSP的引物必須按亞硫酸氫鈉處理后的DNA序列設(shè)計，同時也應(yīng)該盡可能與普通PCR的引物設(shè)計原則相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP擴增時，至少要合成2對引物，即甲基化引物與未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前導(dǎo)引物不含鳥嘌呤堿基，反向引物不含胞嘧啶堿基。初涉及MSP者最好用文獻(xiàn)引物進行研究。如果是為了篩選新的甲基化的抑癌基因而文獻(xiàn)中無法找到的相應(yīng)MSP引物，可用在線MethPrimer軟件在線設(shè)計引物，網(wǎng)址為http://www.urogene.org/methprimer/index1.html.根據(jù)軟件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困難是，要擴增的是啟動子或部分第一外顯子序列，其CG含量相對較高，MSP擴增難度加大，因此設(shè)計好的引物最好用引物軟件如Primer5.0從理論上推測其擴增效率，對于擴增效率<30% 的引物要進行優(yōu)化，方法是：在核心啟動子區(qū)域前后反復(fù)調(diào)整甲基化前導(dǎo)引物擴增起始點，以期使引物擴增效率增高，降低擴增難度，從而提高PCR產(chǎn)量。

2.MSP的反應(yīng)體系問題MSP的反應(yīng)體系的成分與普通PCR一樣，反應(yīng)體系的優(yōu)化也與普通類似，反應(yīng)體系的優(yōu)化與普通PCR的反應(yīng)體系中最大的區(qū)別是DNA模板不同。經(jīng)過修飾后的模板為單鏈狀態(tài)，MSP的DNA模板在抽提后應(yīng)檢測其純度和含量，其純度要求A260/A280在1.8-2.0之間；其含量要準(zhǔn)確檢測，否則在亞硫酸鹽處理時因DNA模板加的太多而導(dǎo)致DNA處理不完全而導(dǎo)致MSP擴增失��；而加的DNA模板太少則一方面浪費試劑，另一方面會因為目的片段太少導(dǎo)致MSP假陰性。Mg“濃度一般在2.0-2.5 mmol/L為宜，過低過高都不利于擴增。此外，PCR的緩沖液及Taq酶的來源也很重要，一般的PCR緩沖液常常會導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，不同來源的Taq酶也會影響結(jié)果的重復(fù)性。我們建議用Taka-ra公司針對富含CG等復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果較好。而一旦選用某一廠家Taq酶后，不要輕易更換，以免MSP因重新優(yōu)化而引起的時間和成本的浪費。

3.MSP的反應(yīng)溫度分析MSP擴增的結(jié)果有3種情況：

(1)產(chǎn)物電泳為陰性；

(2)產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異性條帶(含目的基因條帶)；

(3)產(chǎn)物電泳為陽性(僅目的基因條帶)。出現(xiàn)前2種情況時，可在保證反應(yīng)體系和引物沒有問題的情況下，通過調(diào)整MSP的反應(yīng)溫度而得到目的基因帶。方法如下：PCR反應(yīng)中，Tm的高低與CG含量呈正相關(guān)。因甲基化與未甲基化引物序列差異，在擴增過程中可能會出現(xiàn)PCR偏性。我們建議，提高預(yù)變性溫度(一般應(yīng)>95.C，10 min)和變性溫度(>95℃ ，1min)，退火溫度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。

總之，在MSP全過程中，影響結(jié)果的因素較普通PCR要多得多，只要對實驗過程每一步認(rèn)真控制可完全提高MSP的準(zhǔn)確度和精密度。