1.掌握酵母細(xì)胞的培養(yǎng) 方法

2.學(xué)會(huì)使用相差和微分干涉顯微鏡

二、異源互補(bǔ)技術(shù)概述

釀酒(芽殖)酵母的培養(yǎng)在許多方面可以與大腸桿菌相比較。這種酵母可以用標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)技術(shù)在液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。大多數(shù)酵母菌 株在復(fù)合液體培養(yǎng)基中的倍增時(shí)間為90～120min，到靜止期時(shí)細(xì)胞滴度為3×108到5×108細(xì)胞/mL。單個(gè)細(xì)胞在復(fù)合固體培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)36 hr可長(zhǎng)成1～2mm的單菌落，在合成的有限培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，倍增時(shí)間至少增加為原來(lái)的兩倍，且細(xì)胞的最終滴度僅達(dá)到2×107到3×107細(xì)胞/mL。在有限培養(yǎng)基平板上菌落需大約60 hr才能長(zhǎng)成容易計(jì)數(shù)的大小。在復(fù)合或有限培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落能影印培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移到膜上，進(jìn)行分子水平的分析。

非洲粟酒裂殖酵母和其近親釀酒酵母一樣，是一種子囊真菌，但它與發(fā)芽酵母的關(guān)系并不密切，兩種酵母的蛋白質(zhì)序列和基因同源性在60﹪到90﹪。與釀酒酵母相比，非洲粟酒裂殖酵母通常是單倍體細(xì)胞，可分為兩種交配型，在饑餓情況下不同的交配型單倍體進(jìn)行交配，形成雜合的雙倍體合子。雙倍體合子經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成4個(gè)孢子，由孢子發(fā)芽而長(zhǎng)成單倍體菌落。非洲粟酒裂殖酵母具有典型的真核生物的細(xì)胞周期，包括G1、S、G2和M 四個(gè)時(shí)期。在基本或復(fù)合培養(yǎng)基中其世代時(shí)間為2到4個(gè)h，其中G2期占細(xì)胞周期的70﹪，其它期各占10﹪。

三、材料、試劑和儀器

1. 材料

釀酒芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces kephir)。

2. 試劑

1)釀酒芽殖酵母的培養(yǎng)基

(1)YPD(YPED)液體培養(yǎng)基(用于酵母菌搖培，100mL)

細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨(Bacto-peptone) 2g

細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 (Bacto-Yeast extract) 1g

葡萄糖(Glucose，配成40%detrose貯液?jiǎn)为?dú)滅菌,4℃保存) 2g

加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至4-5，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱(至少室溫放置30min)無(wú)菌的40%detrose貯液。

(2)YPD(YPED)固體培養(yǎng)基(可用于保菌或培養(yǎng)，100mL)

在YPD液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物中加入2g瓊脂粉，加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5.8，定容至95mL，高溫滅菌(121℃, 15min)。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱(至少室溫放置30min)無(wú)菌的40% detrose貯液。

(3)YPAD(斜面)培養(yǎng)基(可用于保菌或培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，100mL)

在YPD液體培養(yǎng)基中加入硫酸腺嘌呤(Adenine hemisulfate salt，腺嘌呤半硫酸鹽)40mg，瓊脂(Bacto-agar)(液體培養(yǎng)基不加)2g。加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5.8(液體調(diào)至4左右)，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱(至少室溫放置30min)無(wú)菌的40%detrose貯液。分裝培養(yǎng)基，傾斜放置形成斜面，每支試管依大小可加入3-5mL培養(yǎng)基。(若葡萄糖直接加入培養(yǎng)基則可先分裝至試管后滅菌(需要棉塞)，滅菌會(huì)造成葡萄糖碳化，培養(yǎng)基略變褐色，對(duì)酵母培養(yǎng)會(huì)略有影響)。該培養(yǎng)基用于4-6個(gè)月的短暫保菌或酵母培養(yǎng)。

2)非洲粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)基

(1)YE培養(yǎng)基(100mL)

酵母提取物 0.5g

葡萄糖(Glucose，配成40%detrose貯液?jiǎn)为?dú)滅菌，4℃保存) 2g

細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Bacto-agar) 2g

加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5-6，定容至95mL，高溫滅菌(121℃,15min)。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱(至少室溫放置30min)無(wú)菌的40%detrose貯液。

(2) YEA培養(yǎng)基(100mL)

YEA配方中含有150mg/L的腺嘌呤。用于培養(yǎng)尿嘧啶缺陷株的培養(yǎng)基，應(yīng)加入150mg/L的尿嘧啶以利于最佳生長(zhǎng)。

3. 儀器

恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，相差/微分干涉顯微鏡，普通光學(xué)顯微鏡

四、實(shí)驗(yàn)程序

1.酵母菌的搖培 無(wú)菌條件下，用接種環(huán)或微量取樣器將酵母菌菌種接種于YPD液體培養(yǎng)基和非洲粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)基，28-30℃,200rpm恒溫?fù)u床搖培過(guò)夜。

2.制片、壓片，明視野顯微觀察。

3.相差顯微鏡的使用與標(biāo)本觀察。

4.液體培養(yǎng)基中細(xì)胞滴度的檢測(cè)

5.分光光度測(cè)定法

1)YPAD過(guò)夜培養(yǎng)物用水稀釋100倍。

2)用分光光度計(jì)測(cè)定600nm處的光密度。

3)記住稀釋倍數(shù)，計(jì)算原始培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)。

例如：在YPAD中100倍稀釋的培養(yǎng)物的OD600為0.21，可按下式計(jì)算：

0.21(OD600)×100(稀釋倍數(shù))×1×106(個(gè)細(xì)胞/mL)/0.1(OD600)=2.1×108個(gè)細(xì)胞/mL

對(duì)于OD600和細(xì)胞滴度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系應(yīng)分別測(cè)定，可通過(guò)將特定OD600的培養(yǎng)物稀釋后涂板檢測(cè)每毫升的活細(xì)胞數(shù)。

6.血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法

1)YPAD過(guò)夜培養(yǎng)物用水稀釋10倍。

2)將細(xì)胞懸液小心地加在蓋片和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器之間。10×物鏡和10×目鏡觀察，相差顯微鏡觀察效果更好。讓細(xì)胞在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的網(wǎng)格中停留幾分鐘。網(wǎng)格區(qū)為1mm2，分成25個(gè)相同大小的方格，其容積為10-4mL。

3)計(jì)數(shù)5個(gè)對(duì)角方格中的細(xì)胞數(shù)量，乘以5即是整個(gè)網(wǎng)格區(qū)細(xì)胞的總數(shù)。

4)計(jì)算細(xì)胞滴度：計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)×5×稀釋倍數(shù)×1/血細(xì)胞計(jì)數(shù)器25個(gè)方格的容積。

例如：5個(gè)對(duì)角方格中計(jì)數(shù)的細(xì)胞為239個(gè)，其滴度計(jì)算應(yīng)是：

239個(gè)細(xì)胞×5×10(稀釋倍數(shù))×1/10-4mL=1.2×108個(gè)細(xì)胞/mL