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1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
制備單克隆抗體包括動物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實(shí)驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗方法。
一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
一 免疫方案
選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip 腹腔內(nèi)注射
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強(qiáng)免疫融合前三天 1×10７／0.5ml ip或iv靜脈內(nèi)注射
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ 一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn)
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
│ ip劑量不宜超過0.5ml
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ 5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原特別是一些弱抗原的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。
二 飼養(yǎng)細(xì)胞
在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞較為常用、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復(fù)蘇。
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備
小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡
↓
拉頸處死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液
↓
反復(fù)沖洗，吸出沖洗液
↓
放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘
↓
用20％小牛血清NCS或胎牛血清FCS的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×10５／ml
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)
一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細(xì)胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細(xì)胞3T31×105／ml，均為100μl／孔。
三 骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb。
常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細(xì)胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。
一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8～AG8氮雜鳥嘌呤篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。
保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計數(shù)高于95％，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。
四 免疫脾細(xì)胞
免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。
二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤
一 細(xì)胞融合流程
1 取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。
6 在室溫下融合:
�、佟�30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEGMerek,分子量4000含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。
�、邸〖宇A(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
9 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
二 HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。
一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清完全培養(yǎng)液中。
因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。
三、抗體的檢測
篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原蛋白質(zhì)、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。
3. FACS熒光激活細(xì)胞分類儀用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。
上述方法均為一般實(shí)驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實(shí)驗過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個篩選時機(jī)。
四、雜交瘤的克隆化和凍存
克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實(shí)際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體特異性抗體分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化�？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
一 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
�、佟≈苽滹曫B(yǎng)細(xì)胞懸液同融合前準(zhǔn)備
�、凇￡栃钥准�(xì)胞的計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細(xì)胞。
�、堋∨囵B(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時進(jìn)行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
�、凇∮蒙鲜�0.5％瓊脂液含有飼養(yǎng)細(xì)胞15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
�、堋�1ml 0.5％瓊脂液42℃預(yù)熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。
�、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
�、蕖�4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
�、摺z測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時再克隆化。
二 雜交瘤細(xì)胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細(xì)胞凍存液:
50％小牛血清
40％不完全培養(yǎng)液
10％ DMSO二甲亞砜
凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細(xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。
五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
1. 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。
2. 體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。
�、佟�(shí)體瘤法 對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。但采血量有限。
② 腹水的制備 常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。
六、單克隆抗體的鑒定
對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗原進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗時，如加入適量的PEG3％，將有利于沉淀線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定：用動物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。
4. McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。
七、影響因素、失敗原因分析
由于制備McAb的實(shí)驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。
2. 融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體
�、佟∪诤虾笥屑�(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。
�、凇∮锌赡苁敲庖咴乖匀�，免疫效果不好。
�、邸τ谠置诳贵w的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。
要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況。
要定期進(jìn)行再克隆。
三不要:
不要讓細(xì)胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。
不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。
不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。
4. 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化
可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。
抗體的制備方法與原理
一、抗血清的制備
有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩�，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價高）的抗體。
（一）用于免疫的動物
作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
�。ǘ┟庖咄緩�
免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。
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由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。
常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。
配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆�。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。
�。ㄋ模┟庖叻椒�
抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。
在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。
圖2-3 抗體反應(yīng)
�。ㄎ澹┛寡宓牟杉c保存
家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
�。┛寡遒|(zhì)量的評價
在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。
1．效價 抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。
�。�1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000�？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章�。�
（2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。
圖2-4 雙向擴(kuò)散模型
圖2-5 免疫擴(kuò)散試驗
2．特異性測定 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。
S=y/Z×100%
S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。
3．親合力 在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度�？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。
計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗情況，只能作為參考。
�。ㄆ撸┟庖呤〉目赡茉蚣皯�(yīng)采取的措施
有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。
（1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)量。
�。�2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。
（3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。
�。�4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。
（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。
�。�6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。
二、單克隆抗體的制備
1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個高度精確的新紀(jì)元。
免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。
表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較
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項目
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常規(guī)免疫血清抗體
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McAb
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抗體產(chǎn)生細(xì)胞
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多克隆性
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單克隆性
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抗體的結(jié)合力
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特異性識別多種抗原決定簇
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特異性識別單一抗原決定簇
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免疫球蛋白類別及亞類
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不均一性，質(zhì)地混雜
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同一類屬，質(zhì)地純一
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特異性與親合力
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批與批之間不同
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特異性高，抗體均一
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有效抗體含量
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0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水）
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0.5～5.0mg/ml小鼠腹水
0.5～10.0μg/ml（培養(yǎng)物上清液）
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用于常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗
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可用
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單抗組合應(yīng)用
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抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)）
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容易形成
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一般難形成
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抗原抗體反應(yīng)
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抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可逆
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可形成2分子反應(yīng)，可逆
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單克隆抗體的制備方法如下。
�。ㄒ唬﹦游锏倪x擇與免疫
1．動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗室多選用純種BALA/C小鼠。
2．免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
�。�1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。
初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點(diǎn)）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）
↓2～3周
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆�；蚬滔嗷环矫嬖鰪�(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性。
（2）顆�？乖庖咝詮�(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細(xì)胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip
↓2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
↓3周后
加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓
取脾融合
�。ǘ┘�(xì)胞融合
1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
�。�1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。
表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細(xì)胞系
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名 稱
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來 源
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耐 受 藥 物
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Ig鏈
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H L
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|||
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P3/X63-Ag8X63
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BALB/C骨髓瘤MOPC-21
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8-氮鳥嘌呤
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r1 K
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P3/X63-Ag8.653X63-Ag8.653
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P3/X63-Ag8
|
8-氮鳥嘌呤
|
－ －
|
|
P3/NSI-1-Ag4-1NS-1
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P3/X63-Ag8
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8-氮鳥嘌呤
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－ K（不分泌型）
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P3/X63-Ag8.UlP3Ul
|
（X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤
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8-氮鳥嘌呤
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－ －
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|
SP2/0-Ag14SP2/0
|
（X63×BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤
|
8-氮鳥嘌呤
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－ －
|
|
F0
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BALB/C骨髓瘤
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8-氮鳥嘌呤
|
－ －
|
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S194/5.XXO.BU.1
|
P3/X63-Ag8
|
5-溴脫氧尿嘧啶核苷
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－ －
|
|
MPC11-45.6TG1.7
|
BALB/C骨髓瘤MPC-11
|
6-巰鳥嘌呤
|
r2b K
|
|
210.RCY3.Ag1.2.3
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LOU大鼠骨髓瘤R210
|
8-氮鳥嘌呤
|
－ K
|
|
GM15006TG-A12
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人骨髓瘤GM1500
|
6-巰鳥嘌呤
|
r1 K
|
|
U-266AR
|
人骨髓瘤U-266
|
8-氮鳥嘌呤
|
ε λ
|
骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。
�。�2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié) 需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。
2．細(xì)胞融合的步驟
�。�1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周
↓
拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）
↓
反復(fù)沖洗，吸出沖洗液
↓
沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)
�。�2）制備免疫脾細(xì)胞
最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死
↓
無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次
↓
脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)
↓
離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次
↓
計數(shù)
↓
取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用
�。�3）制備骨髓瘤細(xì)胞
取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心
↓
用無血清培養(yǎng)液洗2次
↓
計數(shù)，取得×107細(xì)胞備用
�。�4）融合
�、賹⒐撬枇黾�(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。
②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。
③加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
�、茈x心，800rpm, 6min。
�、莩渖锨�，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。
�、迣⑸鲜黾�(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。
�、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
�。ㄈ┻x擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測
1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。
在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。
2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細(xì)胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。
（四）雜交瘤的克隆化
雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實(shí)際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。
1．有限稀釋法克隆
�。�1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。
2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。
�。�3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個細(xì)胞/ml。
�。�4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
�。�5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。
�。�6）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。
�。�7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。
�。�8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。
2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆
�。�1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。
�、�1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
�。�2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
�。�4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。
�。�5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
�。�6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。
�。�7）檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。
�。ㄎ澹╇s交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
1．雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。
細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。
凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。
2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，檢測抗體活性。
�。﹩慰寺】贵w的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
�。�1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。
�。�2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。
�、賹�(shí)體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。
②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。
（七）單克隆抗體的鑒定
對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個方面的鑒定：
1．抗體特異性的鑒定 除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。
2．McAb的Ig類與亞類的鑒定 一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定。在作雙擴(kuò)試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。
3．McAb中和活性的鑒定 用動物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。
4．McAb識別抗原表位的鑒定 用競爭結(jié)合試驗，測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5．McAb親合力的鑒定 用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。
ELISA
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定 Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
一 原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法圖a、用于檢測抗原的雙抗體夾心法圖b以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
二 操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。簡稱洗滌，下同。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體經(jīng)滴定后的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm若以ABTS顯色，則410nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照
中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照
↓
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體抗抗體0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
↓
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
三 試劑器材
1. 試劑
1 包被緩沖液PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液:
Na?CO３ 1.59克
NaHCO３ 2.93克
加蒸餾水至1000ml
2 洗滌緩沖液PH7.4 PBS：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO４·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.05％ 0.5ml
加蒸餾水至1000ml
3 稀釋液：
牛血清白蛋白BSA 0.1克
2. 器材:
1 聚苯乙烯塑料板簡稱酶標(biāo)板40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
2 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
3 4℃冰箱，37℃孵育箱。
四 注意事項
1. 正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
1 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
�。�2 包被抗體或抗原的選擇：將抗體或抗原吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度0.1、1.0和10μg／ml等進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
3 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定見酶標(biāo)記抗體部份。然后再固定其它條件或采取“方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度在正式實(shí)驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
4 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體如OPD等有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
免疫組化染色方法
SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘； 5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘； 5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1脫蠟、水化。
2PBS洗兩次各5分鐘。
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4抗原修復(fù)。
5PBS洗5分鐘。
6滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8PBS洗三次每次2分鐘。
9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10PBC洗3次每次2分鐘。
11滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
1脫蠟、水化。
2PBS洗兩次各5分鐘。
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4抗原修復(fù)。
5PBS洗5分鐘。
6滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8PBS洗三次每次2分鐘。
9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10PBC洗3次每次2分鐘。
11滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
12PBS洗4次每次5分鐘。
13DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15脫水、透明、封片、鏡檢。
13DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15脫水、透明、封片、鏡檢。
常用抗原修復(fù)方法
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片：
1）抗原熱修復(fù) 可根據(jù)實(shí)驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)�？乖瓱嵝迯�(fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調(diào)整。
（1）高壓熱修復(fù) 切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。
（1）高壓熱修復(fù) 切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。
（2）煮沸熱修復(fù) 切片脫蠟至水后，放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，
（3）微波熱修復(fù)。切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘（胰酶的最終濃度可以根據(jù)使用者的要求進(jìn)行調(diào)整，濃度范圍可以從0.05%至0.25%）； 胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。 適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
