1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性

所有嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯擴(kuò)增，且Ct值在16～18之間，其他菌株均無明顯的擴(kuò)增；采用乳桿菌通用引物對所有菌株進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可見到清晰的擴(kuò)增條目。證明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對于嗜酸乳桿菌有較好的特異性。

2.檢測方法的靈敏度

①實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的絕對靈敏度

嗜酸乳桿菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可穩(wěn)定檢測的最低質(zhì)量濃度為0.00058ng/μL。每個(gè)模板添加4μL，即檢測限在3pg左右，本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的絕對靈敏度達(dá)到3pg。

②實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對靈敏度

嗜酸乳桿菌ATCC4356的絕對靈敏度可穩(wěn)定檢出的最低濃度為10³ CFU/mL。根據(jù)絕對靈敏度和相對靈敏度的檢測可得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測限為10³CFU/mL。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性檢測結(jié)果

嗜酸乳桿菌ATCC4356不同的核酸濃度擴(kuò)增，每個(gè)質(zhì)量濃度6個(gè)平行，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值的SD介于0.14～0.56之間，RSD介于0.862%～2.55%之間，均在可接受范圍內(nèi)。證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性較好。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的抗干擾能力

在樣品中混入10³、10⁶CFU/mL的雜菌對實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增是沒有干擾的，且檢出限仍為10³CFU/mL；在不同濃度的嗜酸乳桿菌ATCC4356的核酸中添加300pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922的核酸提取物，各濃度梯度核酸檢出的Ct值均未受影響，證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系抗干擾能力強(qiáng)。

5.模擬樣品的檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲

為驗(yàn)證建立的方法是否可以在實(shí)際樣品中進(jìn)行檢測，在進(jìn)行實(shí)樣檢測之前，利用模擬樣品對該方法進(jìn)行驗(yàn)證。這樣不僅可以節(jié)約時(shí)間，且節(jié)省成本在不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料為基質(zhì)的模擬樣品檢測中，以Ct值為縱坐標(biāo)，以嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株已知的不同稀釋菌數(shù)對數(shù)Lg（CFU/g）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為y=－3.312 4x＋38.939，

R²=0.987，檢測結(jié)果的線性較好且檢測限仍為10³CFU/mL。


6.實(shí)際樣品檢測結(jié)果

11份樣品中，6份樣品檢測出含有嗜酸乳桿菌，編號分別為B1、B4、B6、B7、B8、B9，這與購買樣品的便簽信息一致。檢測結(jié)果可以看出，嗜酸乳桿菌的含量在5.83×10²～3.68×10⁴ CFU/mL之間，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以用砸乳酸菌飲料中對嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量。

討論與結(jié)論

本研究利用設(shè)計(jì)的嗜酸乳桿菌屬的特異性引物建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在乳酸菌飲料中的檢測應(yīng)用。結(jié)果證明，該方法的特異性好，檢測限低，純基因水平檢測限在3pg左右，絕對靈敏度檢測達(dá)到10³CFU/mL，且重復(fù)性較好；在純基因水平與培養(yǎng)物水平的抗干擾能力都很強(qiáng)；模擬樣品檢測中其檢測限未改變，重復(fù)性較好，證明適合在市場檢測中使用；實(shí)際樣品檢測結(jié)果與標(biāo)簽信息一致。并得出嗜酸乳桿菌相應(yīng)的添加量，只是嗜酸乳桿菌的含量有所不同。這一研究證明該方法可應(yīng)用在乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的快速檢測。