向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
樣品消化

濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機(jī)物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質(zhì)會分解為氨，然后氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質(zhì)分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400℃以上。提高溫度使有機(jī)物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達(dá)，有機(jī)物全部消化完全后，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑。
蒸餾

消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉(zhuǎn)化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結(jié)果，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強(qiáng)酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結(jié)合態(tài)的氨完全反應(yīng)并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應(yīng)生成棕紅色的碘化汞銨化合物。吸收

加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應(yīng)。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
滴定

待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須按照要求進(jìn)行配制和標(biāo)定�；旌现甘緞┰谥行匀芤褐谐驶疑�，滴定終點時液體呈灰色。注意事項

①所用的試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制；

②取樣應(yīng)具有代表性,取樣前將樣品充分混勻；

③樣品稱量放入凱氏燒瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失；

④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全，在消化過程中要不時地轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶；

⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時，易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出，消化時應(yīng)先消化加熱并不斷搖動，或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑；

⑥當(dāng)樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后，再加入30%的過氧化氫，然后繼續(xù)加熱消化；

⑦加堿后，漏斗要進(jìn)行水封，避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；

⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣；

⑨在蒸餾時反應(yīng)室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發(fā)生倒吸；

⑩蒸餾前如果加堿后消化液呈藍(lán)色而沒有生成氫氧化銅沉淀，說明加入的堿量不足，需要適量補(bǔ)加堿；,蒸餾時為防止水蒸氣發(fā)生器內(nèi)液體爆沸，加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直徑最好大于聯(lián)通的玻璃管直徑，以免玻璃珠進(jìn)入玻璃管內(nèi)影響蒸汽均勻、充足的輸出； -冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸餾完畢后先將冷凝管下端提離液面，再蒸1min后清洗管口，再移開吸收瓶，最后關(guān)掉熱源，否則可能發(fā)生倒吸。
常見問題解答

一、消化過程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶內(nèi)有黑色殘留物怎么辦？ 

解答：稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結(jié)果偏低。消化過程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時搖動定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側(cè)甩，使瓶內(nèi)液體呈半旋轉(zhuǎn)半振蕩狀態(tài)，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。 

二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？ 

解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，從而加快有機(jī)物分解。

三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？ 

解答：硫酸銅的作用有三個，分別為： 

①催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。 

②消化完全的指示劑：使液體呈現(xiàn)藍(lán)綠色澄清透明狀態(tài)。 

③蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑：產(chǎn)生褐色沉淀。

四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？

解答：混合指示劑必須臨用時混合。

五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會有誤差嗎？

解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結(jié)果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。

六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？

解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產(chǎn)生 

七、硼酸可以多加嗎？ 

解答：不可以。按國標(biāo)的要求正確操作，10mL硼酸足夠。 

八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？

解答：不能更改國標(biāo)給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當(dāng)減少稱樣量，或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。 

九、空白消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積指的是什么？ 

解答：試劑空白實驗消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積就是空白體積。

十、同時有兩種蛋白怎么換算？

解答：同時含有多種蛋白質(zhì)，且折算系數(shù)不相同時可以按復(fù)合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。

結(jié)語：凱氏定氮法經(jīng)典、準(zhǔn)確，適用于食品中蛋白質(zhì)的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以凱氏定氮法測定結(jié)果為樣品中粗蛋白質(zhì)含量。然而，此法實際上測的不是蛋白質(zhì)含量，而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產(chǎn)生誤差的主要原因，因此要格外注意。在實際的生產(chǎn)實驗中，每一步應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定來進(jìn)行操作。本文為筆者日常工作實驗總結(jié)所得，望對實驗者有些許幫助。

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