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不同方式混合流動相是否會影響保留時間?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-07-24
核心提示:緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿(或弱堿及其共軛酸)所組成的緩沖對配制的,且能夠在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時,可以有效減緩pH值改變
緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿(或弱堿及其共軛酸)所組成的緩沖對配制的,且能夠在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時,可以有效減緩pH值改變的水溶液。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定,而不會因為微弱的環(huán)境改變的情況下而造成分析結(jié)果的改變。

緩沖溶液是被用來維持pH值的穩(wěn)定。它們是通過維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變。


緩沖溶液是如何工作的?

根據(jù)Le Chatelier原理,當(dāng)一些強(qiáng)酸 (或者更多的氫離子“H+”) 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時,平衡會被向左移動。同樣,如果在混合物中加入強(qiáng)堿,氫離子濃度下降的幅度會小于所預(yù)期加入堿的量。

當(dāng)配制緩沖溶液時,你應(yīng)該遵循以下幾個原則

1.在配制緩沖液前,建議用定值校準(zhǔn)緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品來校對電子pH計

2.根據(jù)所需緩沖液的濃度,精確地稱出所需緩沖鹽的重量

3.把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級超純水的容量燒瓶中,并充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?br /> 緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿(或弱堿及其共軛酸)所組成的緩沖對配制的,且能夠在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時,可以有效減緩pH值改變的水溶液。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定,而不會因為微弱的環(huán)境改變的情況下而造成分析結(jié)果的改變。

緩沖溶液是被用來維持pH值的穩(wěn)定。它們是通過維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變。


緩沖溶液是如何工作的?

根據(jù)Le Chatelier原理,當(dāng)一些強(qiáng)酸 (或者更多的氫離子“H+”) 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時,平衡會被向左移動。同樣,如果在混合物中加入強(qiáng)堿,氫離子濃度下降的幅度會小于所預(yù)期加入堿的量。

當(dāng)配制緩沖溶液時,你應(yīng)該遵循以下幾個原則

1.在配制緩沖液前,建議用定值校準(zhǔn)緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品來校對電子pH計

2.根據(jù)所需緩沖液的濃度,精確地稱出所需緩沖鹽的重量

3.把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級超純水的容量燒瓶中,并充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?br />
4.使用pH探針或pH計去測量溶液的pH值

5.通過添加少量的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿,將容液的pH值調(diào)整至所需的值

6.調(diào)整至所需pH值后,將溶液用色譜級超純水稀釋至最終的所需體積容量,并混合均勻

HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外,緩沖液也被用來工作分析物的電離狀態(tài),以確保分析物不會同時出現(xiàn)一個以上的電離狀態(tài)。

化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時的pH值。如果在此pH值下分析此化合物,你會看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時間。因此,我們建議所有的分析方法的pH值都應(yīng)該控制在目標(biāo)分析化合物的pKa值正負(fù)兩個pH單位以上。

當(dāng)配制等度流動相的時候,我們還需要考慮以下幾個因素來確保方法的穩(wěn)定

1.盡可能提前預(yù)混合你所使用的流動相,因為這將防止經(jīng)過泵混合流動相時會出現(xiàn)的錯誤

2.每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程。例如,如果你方法是先加水,那你每次都必須是先加水。如果你是先測定單獨的成分然后再混合,那你就必須每次都按這個流程來做。記得千萬不要改變這一個固定的配制流程,因為這個配制流程的改變讓分析物的保留時間可能出現(xiàn)很大的改變

以下的這個實驗例子展示了當(dāng)流動相用以下不同的方式來混合時,峰保留時間可能出現(xiàn)的改變

方法一

先加水:先用量筒量400毫升的水并倒進(jìn)1升的容量瓶中,然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度

方法二

先加甲醇:先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)1升的容量瓶中,然后用水稀釋至容量瓶的刻度

方法三

甲醇和水各自先量好:先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)流動相瓶中,然后用同樣的量筒量400毫升的水并倒進(jìn)已經(jīng)裝有甲醇的流動相瓶中

方法四

讓液相的泵來混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇


緩沖液的濃度也是很重要的。我們一般認(rèn)為,10mM以下的濃度不足夠提供可以控制化合物硅醇活性或者電離狀態(tài)所需要的緩沖能力,因此10mM是反相或者HILIC色譜模式下的最低有效濃度。對于其他色譜模式,如體積排阻色譜就需要更高的緩沖液濃度,使用超過100mM濃度的緩沖液在體積排阻色譜法中并不罕見。

緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好,以確保在所有的條件下都能達(dá)到完全溶解。在反相條件下,如果方法條件是包含了高比例有機(jī)相的話(例如跨度很大的梯度),則很有可能需要控制緩沖液的濃度,以確保不會出現(xiàn)緩沖鹽的析出。

當(dāng)開發(fā)一個可靠穩(wěn)定的HPLC方法時,流動相的貢獻(xiàn)跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要,另外流動相的選擇與配制跟色譜柱固定相批次間的質(zhì)檢也是一樣重要的。
文章來源:網(wǎng)絡(luò)
編輯:songjiajie2010

 
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