SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法

　　　　GB/T 4789.6-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)

　　　　GB/T 4789.6-1994 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)（已經(jīng)作廢）

以SN標(biāo)準(zhǔn)方法為例，進(jìn)行說明。

樣品制備：
　　以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000 r/min均質(zhì)1～2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。
　　稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì),用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。

　　附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法？

LST和EC初步篩選：
　　對每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1℃培養(yǎng)48±2h。

　　觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內(nèi),培養(yǎng)48±2h。

　　附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？

EMB平板：

　　取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板,36±1℃培養(yǎng)24±2h。

　　檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

　　如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落；如無典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1℃培養(yǎng)18～24h。

　　附：怎樣進(jìn)行平板劃線分離？

　　　　平板劃線示例

　　　　EMB平板原理及照片

生化試驗(yàn)：
　　將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)�！　�
　　1　色氨酸肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。

　　附：靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片

　　2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽性。
　　將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。

　　附：MR-VP試驗(yàn)原理及照片

　　3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h記錄有無生長。

　　附：枸椽酸鹽利用試驗(yàn)原理及斜面顯色照片

　　4 LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。
　　5　革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：

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　　靛 基 質(zhì)┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定(型別)
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　�。� 　　┃ 　－ 　　　┃典型大腸桿菌
　　　�。�　┃ 　�。�　 　┃ 　�。� 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大腸桿菌
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　　　�。�　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中間型
　　　�。�　┃　　 ＋ 　　┃ 　�。� 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中間型
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　　　�。�　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型產(chǎn)氣腸桿菌
　　　�。�　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ �。� 　　　┃非典型產(chǎn)氣腸桿菌
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　　如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線分離,必要時(shí)做
重復(fù)試驗(yàn)。

結(jié)果報(bào)告：

　　大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為＋＋－－或－＋－－,再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。