雞貧血病毒（CAV）是免疫抑制性疾病～雞傳染性貧血�。–IA）的主要病原，其不但引起骨髓等造血組織萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重貧血甚至死亡，而且引起胸腺等淋巴組織萎縮，導(dǎo)致免疫抑制。

    自日本1979年首次報道該病以來，世界主要養(yǎng)禽國家，如英國、丹麥、波蘭、美國、澳大利亞、荷蘭、巴西和阿根廷等國先后發(fā)現(xiàn)該病的存在。我國于1992年在黑龍江首次分離到該病毒，隨后在遼寧、吉林、山東、江蘇、河南等地的雞群中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，正在直接或間接地對世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。下面就對該病的診斷方法作一綜述。

    1 臨床癥狀

    采用1日齡SPF雛雞接種感染CAV后發(fā)生貧血癥狀，測定紅細胞壓積值，病雞血液的血細胞壓積值（HCT）明顯降低，各種血液細胞數(shù)量明顯減少，發(fā)病嚴(yán)重情況下HCT值可降到10%以下，血細胞數(shù)可降到1×10E6/ml以下。實驗室內(nèi)常將HCT作為CIA的一個診斷指標(biāo)，一般將HCT低于27%判為發(fā)病。

    2 病原學(xué)診斷

    2.1 病毒的分離

    無菌操作采集可疑病例的肝臟，也可采集胸腺、骨髓、脾臟等組織。將采集的病料用滅菌PBS研磨，加入終濃度1000IU/ml的雙抗于37℃作用30min，反復(fù)凍融3～4次，離心;上清液加入50%體積氯仿作用15min，期間不停振搖，70℃處理5min，離心;上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，置低溫冰箱凍存，待進行病毒分離試驗。體內(nèi)病毒分離實驗的接種對象為1日齡SPF雛雞，體外病毒分離用MDCC～MSB細胞。過濾除菌后的病料上清接種MSBl細胞培養(yǎng)，可以用于雞貧血病毒的分離鑒定。接種病毒后，每隔2～3天傳代一次，連續(xù)傳4～7代，如果出現(xiàn)細胞腫脹，變大變圓，隨后有側(cè)解，細胞培養(yǎng)液不再變色，無法繼續(xù)傳代，可以初步確定為有CAV的存在。MSBl細胞也可以用于雞貧血病毒的毒價滴定，連續(xù)稀釋后的病毒接種MSBl細胞，在細胞板上連續(xù)傳4代以上，觀察細胞病變，也可以傳1代后，用熒光抗體來檢查雞貧血病毒的存在和病毒的滴度。

    2.2 病毒鑒定

    病毒的鑒定可以采用間接熒光法檢測抗原。取敏感動物實驗感染雞肝臟做組織冰凍切片，CAV感染陽性組織切片在顯微鏡下可見熒光標(biāo)記。

     CAV感染陽性細胞涂片在熒光顯微鏡下可見MDCC～MSBl細胞腫脹，細胞核內(nèi)顆粒狀或彌散狀熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記細胞的多少與毒株的感染力有關(guān)。陽性對照可見到同樣結(jié)果，熒光標(biāo)記細胞在30%～60%左右，陰性對照細胞內(nèi)不出現(xiàn)熒光顆粒。

    3 血清學(xué)診斷

    CAV感染1日齡雛雞后產(chǎn)生的中和抗體能維持20周，感染10周齡以上的成雞后所產(chǎn)生的中和抗體能維持10～63周（一般為44周以上）。但是目前的研究一致表明，CAV感染雞血清中的中和抗體滴度較低，最高值為1∶5120，最低值為1∶20，低水平的母源抗體能有效地抵抗CAV的感染。病毒中和試驗（VN）、間接熒光抗體試驗、免疫過氧化物酶試驗（IFA）和ELISA試驗可用于檢查血清和卵黃中的抗體。

    3.1VN試驗

    以56℃滅活30min的血清與2×10E3CEDso（可使50%雛雞致病的有效劑量）或200TCID50的病毒等體積混勻，37℃1h或4℃過夜，然后肌肉接種1日齡雛雞，連續(xù)觀察14天，雞健存;或MSBl細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)7代以上，細胞新陳代謝仍活躍，可判定抗體陽性。若作大批血清樣本檢測，一般采用微量VN反應(yīng)法。有時較低稀釋度的血清對細胞會有毒性或易引起對病毒的非特異性抑制。VN法的檢測靈敏度要高于其他血清學(xué)方法。在CAV感染雞產(chǎn)生的中和抗體的維持時間要明顯長于IFA抗體維持時間。此方法有二個局限性：（1）使用該方法需至少培養(yǎng)7代MSBl細胞才可獲得血清的終點滴度;（2）VN法不適用于一些在MSBl不同的亞系上生長不良或不能復(fù)制的CAV毒株。

    3.2

    間接熒光抗體試驗（1FA）MDCC～MSBl細胞培養(yǎng)收獲的病毒可作為細胞抗原檢測血清。該抗原可與CAV陽性血清反應(yīng)，用熒光標(biāo)記的抗雞IgG顯示，熒光顯微鏡下觀察，在腫脹的細胞核區(qū)出現(xiàn)較小的、形態(tài)不規(guī)則的熒光染色顆�；蜉啳h(huán)狀結(jié)構(gòu)，可判為抗體陽性。但應(yīng)設(shè)立嚴(yán)格的陽性血清、陰性血清和非CAV感染細胞作對照，以排除非特異性熒光和可能掩蓋特異性反應(yīng)的背景染色。

    3.3ELISA試驗

    以部分純化的細胞培養(yǎng)毒直接包被ELISA板或用單克隆抗體包板捕獲細胞培養(yǎng)物中的病毒，可用于檢測血清抗體，并且都已用于商品化試劑盒的生產(chǎn)，但由于病毒復(fù)制量較低，成本較大，難以大批量生產(chǎn)和推廣。Kling（1991）、Otaki（1991）和王笑梅（1998）用病毒感染細胞或裂解上清液作為包被抗原建立了ELISA檢測方法，但效果不如純化或半純化的病毒。Pallister（1994）以大腸桿菌內(nèi)表達的重組VPl建立間接ELISA、Kato（1995）以大腸桿菌內(nèi)表達的LacZ～VP3重組物建立間接ELISA、1wata（1997）以昆蟲細胞內(nèi)表達的VP2和/或VP3表達物包板建立ELISA，都可檢測雞血清中的CAV抗體，并且與其他檢測方法（如IFA、VN等）結(jié)果的吻合性較好。因此，由于各CAV毒株的基因序列的保守性，以CAV基因的體外表達產(chǎn)物純化物作ELISA檢測原，用于檢測雞血清抗體的ELISA，被證明是既特異又敏感的方法，為CAV血清學(xué)診斷開辟了一條新的途徑。

    4生物技術(shù)方法診斷

    隨著分子生物學(xué)新方法的不斷出現(xiàn)，PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)以及第二代ELISA技術(shù)等已用于CAV特異性檢測。對CAV抗原的檢測可采用PCR方法，C.Some（1993）報道，利用PCR技術(shù)可以從CAV感染雞體組織內(nèi)或感染細胞內(nèi)檢測其DNA。Noteborn等采用同位素標(biāo)記克隆化的CAV基因組作探針進行雜交實驗，能夠檢測出不同毒株感染的細胞中雙鏈復(fù)制型及單鏈環(huán)狀CAV基因組。Todd等用P32標(biāo)記的克隆化CAVDNA片段作探針，可檢測到CAV感染雞組織中特異性DNA，隨后Noteborn等用非放射性的地高辛（Digoxigenin）標(biāo)記探針，成功地檢測了多株CAV分離株。1995年Nielsen等用生物素標(biāo)記的雙股DNA探針進行原位雜交試驗，不僅可以檢測到人工感染發(fā)病雞體內(nèi)的CAV，而且可以檢測患藍翅病病雞體內(nèi)所含的CAVDNA。

    為適應(yīng)檢測敏感性的需要，CAV特異性PCR技術(shù)在實驗室診斷及疫苗試驗上充分體現(xiàn)了該法不可比擬的優(yōu)勢，它不僅與病毒分離法一樣敏感，而且能檢測到高背景DNA下的CAV分子。Soine等利用套式PCR法（多組引物）擴增出能和特異性探針發(fā)生雜交的CAV基因，但此法易造成假陽性結(jié)果。CAV感染劑量大小將直接影響其致病程度，故檢出敏感細胞或組織中的病毒含量尤為重要。Dren等采用熱啟動PCR法不僅克服了上述缺陷，而且還成功地檢測到一個感染細胞，相當(dāng)于10TCIDs0的CAV分子。