1.用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌對數(shù)生長期(培養(yǎng)3天)的CTLL-2細胞兩次,每次250×g離心10分鐘,洗去培養(yǎng)液中殘存的IL-2。
2.用臺盼藍(1% Trypan blue)染色法計數(shù)細胞并決定細胞的活力,用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞至1×105/ml。
3.在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加0.1ml倍比稀釋的標準IL-2或待測樣品,每個稀釋度三個復孔,標準IL-2從40 IU/ml稀釋到0.019 IU/ml(8~10個稀釋度),陰性對照孔不加IL-2。
4.每孔加0.1ml細胞懸液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時。每孔加10μl(0.5μCi或1.85×104Bq)[3H]脫氧胸苷,繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
5.用多頭細胞收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙上,用3%醋酸水溶液濾紙3次,洗去游離的[3H]TdR。將濾紙置液體閃爍瓶中,加入5ml閃爍液。在液體閃爍儀上計數(shù)細胞攝入的同位素活性(每分鐘放射性計數(shù),cpm),根據(jù)儀器效率換算成dpm(每分鐘衰變數(shù))。
6.用dpm值對樣品稀釋倍數(shù)作圖。在圖上,標準IL-2的曲線與待測樣品的曲線應當呈平行的S型,說明是同樣的分子反應。比較同樣dpm處的不同稀釋倍數(shù),決定待測樣品的相應濃度。