支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨(dú)立生活的微生物.約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。
支原體形態(tài)多變,在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu).其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似,但微絨毛電子密度比支原體小,且中央無顆粒群
或中央束。
支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O 2或葡萄糖,每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0),對酸耐受性差。對熱比較敏感,對一般抗生素不敏感。
支原體污染細(xì)胞后.培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁.多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著,細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解.因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者,可致細(xì)胞增殖緩慢.甚至從培養(yǎng)器皿脫落。
為確定有無支原體污染可做如下檢酗:
①相差顯微境檢測:將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上,24h后取出,用相差油鏡觀察.支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。
②熒光染色法:熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258,可使支原體內(nèi)含有的DNA著色,染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下:首先將細(xì)胞接種蓋玻片上,在細(xì)胞未長滿前取出玻片,用不合酚紅的Hanks液漂洗一下,用l: 3醋酸甲酵固定10Min,然后用生理鹽水漂洗.置于用生理鹽水配濃度為50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min.向細(xì)胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴,然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。
③電鏡檢查;用掃描電鏡方法簡便快速.也可以利用透射電鏡。
④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法:檢出率高.但方法較為復(fù)雜
支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物,大小一般在0.3-0.5um之間,呈高度多形性,有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞,也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色,用姬姆薩染色很淺,革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長,營養(yǎng)要求比細(xì)菌高。
細(xì)胞培養(yǎng)(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染是個(gè)世界性問題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%,支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá),又不能通過可視法對其進(jìn)行檢測,而且它對細(xì)胞的生長率影響較小,不易引起注意。國內(nèi)外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。以上是最常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群,但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的,國外調(diào)查證明,大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞,有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。
組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中,主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作;細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌;在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細(xì)胞后,特別是重要的細(xì)胞株,有必要清除支原體,常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁,一般來講,對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素,如 -內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用,所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體,不影響細(xì)胞本身的代謝,并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞,不會(huì)重新感染支原體。