分為六個階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

[階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈]

1．在置于冰上的無菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第一鏈的合成：

poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl₂ 2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制劑（選用） 25單位

加H₂O至 48μl

2．當(dāng)所有反應(yīng)組在0℃混合后，取出2.5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1μl [α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

4．溫育接近結(jié)束時，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70℃溫育10 min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。

5．參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。

6．按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：

[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

7．盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。

[階段2：cDNA第二鏈的合成]

1．將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中：

10 mmol/L MgCl₂ 70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl

10 mCi/ml[α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl

1 mol/L (NH₄)₂SO₄ 1.5μl

RNase H (1000單位/ml) 1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機(jī)稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2．溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：

β-NAD (50 mmol/L) 1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl

室溫溫育15min。

3．溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。

4．取出3μl反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質(zhì)量。

5．將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。

6．將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl

T4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1μl

室溫溫育15分鐘。

7．測定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度，并按分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法測定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

8．用下面公式計算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。

[第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg

x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%

9．用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應(yīng)物進(jìn)行抽提。

10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進(jìn)行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。

11． 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機(jī)上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監(jiān)測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。

12． 用70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。

13． 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

14． 如果需要用EcoR I甲基化酶對cDNA進(jìn)行甲基化，可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。

[階段3：cDNA的甲基化]

1．在cDNA樣品中加入以下試劑：

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl

5 mol/L NaCl 2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl

加H₂O至 96μl

2．取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。

3．在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。

4．再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。

5．在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100 ng質(zhì)粒DNA或500 ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實驗中用作底物以測定甲基化效率。

6．所有四份小樣實驗反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37℃溫育1h。

7．于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。

8．在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。

9．按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：

a. 在每一對照反應(yīng)中分別加入：

0.1 mol/L MgCl₂ 2μl

10×EcoR I 緩沖液 2μl

加H₂O至 20μl

b. 在2號和4號反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR I。

c. 四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

10． 微量離心機(jī)以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl 70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。

11． 用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl TE（pH8.0）。

12． 盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一階段。

[階段4：接頭或銜接子的連接]

cDNA末端的削平

1．cDNA樣品于68℃加熱5 min。

2．將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 10μl

dNTP溶液，每種5 mmol/L 5μl

加H₂O至 50μl

3．加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以終止反應(yīng)。

5．用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

6．在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15 min。

7．在微量離心機(jī)上以最大速度離心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

接頭-銜接子與cDNA的連接

8．將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 2μl

800~1000 ng的磷酸化接頭或銜接子 2μl

T4噬菌體DNA連接酶（10⁵ Weiss單位/ml） 1μl

10 mmol/L ATP 2μl

混勻后，在16℃溫育8~12h。

9．從反應(yīng)液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應(yīng)液于68℃加熱15min以滅活連接酶。

[階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制備

1．用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進(jìn)1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

2．將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。

3．在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。

4．將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子底部的軟管。

依據(jù)大小分離回收DNA

5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更小），放開止血鉗，使cDNA進(jìn)入凝膠。用50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。

6．用手提式小型探測器監(jiān)測cDNA流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

7．用切侖科夫計數(shù)器測量每管的放射性活性。

8．從每一管中取出一小份，以末端標(biāo)記的已知大�。�0.2kb~5kb）的DNA片斷作標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。

9．電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù)干燥1~2h.

10． 置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。

11． 在cDNA長度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。

12． 將DNA溶于總體積為20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13． 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA

[階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接]

1．按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng)：

連接	A(μl)	B(μl)	C(μl)	D(μl)
λ噬菌體DNA(0.5μg/μl)	1.0	1.0	1.0	1.0
10×T4DNA連接酶緩沖液	1.0	1.0	1.0	1.0
cDNA	0 ng	5 ng	10 ng	50 ng
T4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml）	0.1	0.1	0.1	0.1
10 mmol/L ATP	1.0	1.0	1.0	1.0
加H2O至	10	10	10	10

連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

2．按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

3．包裝反應(yīng)完成后，在各反應(yīng)混合物中加入0.5ml SM培養(yǎng)基。

4．預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養(yǎng)8~12小時。

5．計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應(yīng)A不應(yīng)產(chǎn)生重組噬菌斑，而連接反應(yīng)B、C和D應(yīng)產(chǎn)生數(shù)目遞增的重組噬菌斑。

6．根據(jù)重組噬菌斑的數(shù)目，計算cDNA的克隆效率。

7．挑取12個重組λ噬菌體空斑，小規(guī)模培養(yǎng)裂解物并制備DNA，以供適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化。

8．通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質(zhì)量參照。