一、放射免疫分析的基本試劑
。ㄒ唬(biāo)準(zhǔn)品
標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù),由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來表示被涮物質(zhì)的量,故標(biāo)準(zhǔn)品與被測(cè)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外,還應(yīng)具備穩(wěn)定性,即在合理的貯存條件下保持原來的特性。
按實(shí)驗(yàn)要求,將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)標(biāo)記物
標(biāo)記抗原應(yīng)具備:①比放射性高,以保證方法的靈敏度;②免疫活性好;③所用的核素的半衰期盡可能長(zhǎng),標(biāo)記一次可較長(zhǎng)時(shí)間使用,這對(duì)來之不易的抗原尤其重要;④標(biāo)記簡(jiǎn)便、易防護(hù)。要準(zhǔn)確測(cè)量B與F的放射性,必須有足夠的放射性強(qiáng)度。所選用的標(biāo)記抗原的量,在使用125I時(shí)達(dá)5000~15000cpm。
。ㄈ┛贵w
應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)及滴度好的抗體,用于放射免疫測(cè)定。
根據(jù)稀釋曲線,選擇適當(dāng)?shù)南♂尪,一般以結(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。
。ㄋ模〣與F分離劑
以2%加膜活性炭溶液為例,2%加膜活性炭溶液的配制:
活性炭2g(杭州木材廠生產(chǎn),森工牌732型)右旋糖酐T200.2g加0.1mol/L PB 至100ml電磁攪拌1h,然后置于變通冰箱冰箱待用。
。ㄎ澹┚彌_液
放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種,要通過實(shí)驗(yàn)選用抗體和抗原結(jié)合最高的緩沖液。目前最常用的緩沖液有下列幾種:①磷酸鹽緩沖液;②醋酸鹽緩沖液;③巴比妥緩沖液;④Tris –HCl緩沖液;⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用最多。
在緩沖液中,除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外,還應(yīng)根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目加入下列物質(zhì):①保護(hù)蛋白:常用的有牛血清白蛋白或白明膠,濃度為0.1%~0.2%,用以降低試管對(duì)抗原的非特異性吸附。②防腐劑:多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑:如測(cè)定心鈉素等肽類激素時(shí),要加入適量的抑肽酶,用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對(duì)待測(cè)物的降解;又如測(cè)定cAMP、cGMP時(shí),需加入EDTA·2Na,抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑:在測(cè)定甲狀腺激素或測(cè)定某些甾體激素時(shí),必須加阻斷劑,使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素,變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白:采用二抗作B與F分離劑時(shí),要向反應(yīng)液中加入適量與第一抗體同種動(dòng)物的正常血清。在測(cè)定不含有血漿蛋白的樣品時(shí),用PEG沉淀劑分離B、F,必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。
在神經(jīng)肽的RIA時(shí),常用PELH緩沖液,(按1000ml,pH7.6):0.1mol/l PB 980.0ml 0.3mol/L EDTA·2Na 10.0ml 0.2%洗必泰溶液 10.0ml 溶菌酶 1.0g
二、加樣程序
由于抗原、標(biāo)記抗原和抗體三者加樣次序不同,而出現(xiàn)兩種加樣程序,分述如下:
。ㄒ唬┢胶怙柡图訕映绦
1.基本原理所謂平衡飽和,是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合,也不解離的平衡狀態(tài),稱為飽和狀態(tài),即平衡飽和。所以,有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測(cè)抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。
2.加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)樣品,再加抗血清,最后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)物與抗體有短暫的結(jié)合,提高抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制能力。
在小分子半抗原的放射免疫分析中,標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的,前者比后者的親合力高。因此,上述加樣程序就更有必要,所以一般都采用先加標(biāo)準(zhǔn)物或樣品和抗血清,后加標(biāo)記物。這樣測(cè)定也比較穩(wěn)定。
在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中,如果是雙抗體分離法,抗原和標(biāo)記抗原與抗體三者加樣,可不分先后,有的是標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)記物、抗血清的加樣順序,但一般習(xí)慣還是標(biāo)準(zhǔn)物或血樣、抗血清、標(biāo)記物、然后混勻溫育24~48h,再加雙抗體,繼續(xù)溫育24h,使免疫反應(yīng)達(dá)到平衡。對(duì)一些多肽激素的放射免疫分析,應(yīng)用雙抗體分離法,其流程比較長(zhǎng),這樣的順序同樣可不分先后。
以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測(cè)定程序?yàn)槔?br /> 。1)加樣(單位μl;總反應(yīng)體積500μl) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品
T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂體 下丘腦
管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
β-EP標(biāo)準(zhǔn)液 / / / 100 100 100 100 100 100 / /
樣品 / / / / / / / / / 1 100
β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100
125-β-EP溶液 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
緩沖液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200
。2)孵育:4℃,24h
(3)分離B與F:每管加入2%加膜活性炭溶液300μl,搖勻,立即離心,去上清,測(cè)沉淀(F)的CPM數(shù)。
。ǘ╉樞蝻柡图訕映绦
1.基本原理先將標(biāo)準(zhǔn)物或血樣品與抗血清混勻,免疫反應(yīng)6~24h,使抗原與抗體充分結(jié)合,甚至達(dá)到平衡,然后再加入標(biāo)記抗原,與抗體反應(yīng)12~24h,最后分離B與F,這稱為順序飽和分析法。
應(yīng)用順序飽和加樣,可以提高測(cè)定方法的靈敏度。Utiger在做人促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析時(shí),將標(biāo)記物延至第2天加入,發(fā)現(xiàn)其靈敏度增加兩倍。如果縮短最后的溫育時(shí)間,仍可取得滿意的結(jié)果。所以一般認(rèn)為,在順序飽和加樣中,第1次溫育時(shí)間可以長(zhǎng),而第2次溫育時(shí)間要短,這樣可以提高靈敏度。但也有相反的意見,認(rèn)為順序飽和加樣,是使用過量抗體,會(huì)使靈敏度受到一定影響。如果使用抗體不過量,溫育時(shí)間縮短,在抗原和抗體結(jié)合未達(dá)到平衡飽和時(shí)就加入標(biāo)記物,這樣既不影響加靈敏度,反而比較穩(wěn)定,甚至可提高靈敏度。
2.加樣程序 以人血漿精氨酸加壓素RIA測(cè)定程序?yàn)槔ㄖ苯訙y(cè)定)。
(1)加樣(單位μl;總反應(yīng)體積600μl) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 血漿
T NSB Bo 1Pg 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg
管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AVP標(biāo)準(zhǔn)液 / / / 100 100 100 100 100 100 /
樣品 / / / / / / / / / 300
無肽血漿 / 300 300 300 300 300 300 300 300 /
AVP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100
緩沖液 / 200 100 / / / / / / 100
在4。C下孵育12~24h
125I-AVP 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
(2)孵育:4℃,24h。
。3)分離B與F。
無肽血漿,用于血漿的直接測(cè)定。其制備方法為:在電磁攪拌下,抽取2%加膜活性炭溶液5ml,共兩管,離心、去上清。血漿5ml,倒入上述活性炭管中,加蓋,充分振蕩10min,離心,上清倒入上述另一活性炭管中,振蕩10min,再離心,取上清,即無肽血漿。血漿中的生物活性物質(zhì)被活性炭吸附而去除。
。ㄈ┯(jì)數(shù)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與測(cè)定樣品含量
以活性炭分離B與F,沉淀計(jì)數(shù)是F的cpm。T—F—NSB,得B的cpm數(shù)。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管結(jié)合(B)的cpm數(shù)及與零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合(B0)的比(B/B0×100%)。
用半對(duì)數(shù)紙,以標(biāo)準(zhǔn)管的B/B0為縱座標(biāo),以各標(biāo)準(zhǔn)管含量為橫座標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)樣品的結(jié)合率(B/B0×100%),從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出被測(cè)樣品抗原的含量,再換算成每毫升血漿含某抗原的量,或每毫克(組織濕重)含某抗原的量。
三、放射免疫分析的質(zhì)量控制
(一)質(zhì)量控制的目的和內(nèi)容
放射免疫分析的質(zhì)量控制實(shí)際上就是控制測(cè)定誤差,監(jiān)督測(cè)定結(jié)果。它包括兩方面的內(nèi)容:一方面對(duì)測(cè)定結(jié)果做精確分析;另一方面鑒定常規(guī)測(cè)定方法,對(duì)那些測(cè)定結(jié)果不好的方法加以改進(jìn),并建立新的測(cè)定方法。質(zhì)量控制分四個(gè)方面:
1.在一個(gè)測(cè)定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。
2.在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤差。
這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。
3.用同一測(cè)定方法,在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。
4.采用不同方法,在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。
后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。
(二)放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素
誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測(cè)量過程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因,使測(cè)定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小,這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測(cè)量過程中各種偶然因素造成的,沒有固定的傾向性,這類誤差是不可避免的,必要時(shí)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
造成誤差的可能來源有以下幾個(gè)方面:
1.各種儀器:設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如:①由于放射性測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測(cè)物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收,本底校正,測(cè)定時(shí)間,可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測(cè)定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來誤差。
2.試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度,輻射自分解,抗體的穩(wěn)定性,分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。
3.在放射免疫分析中一些基本操作,如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差,如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。
4.樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件,微量樣品取樣的準(zhǔn)確度,樣品可能造成的污染以及樣品的變性(如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等)也都能造成測(cè)量的誤差。
5.提取及層析分離過程中的丟失。
。ㄈ┓派涿庖叻治鲋袦y(cè)量誤差的控制
1.選擇準(zhǔn)確性高的方法:對(duì)各種方法進(jìn)行比較,淘汰粗糙及難以重復(fù)的方法。
2.建立方法對(duì)比。用相同的測(cè)量方法和不同的測(cè)量方法在同一實(shí)驗(yàn)室和不同實(shí)驗(yàn)室,在同一地區(qū)和不同地區(qū),在同一時(shí)間和不同時(shí)間,對(duì)同一樣品進(jìn)行對(duì)比,檢查產(chǎn)生誤差的原因。
3.建立各種類型的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)規(guī)定純度及制備方法,使用年限及貯存條件。
4.建立操作規(guī)程,按章 操作。對(duì)使用的試劑、儀器設(shè)備要經(jīng)常檢查其有效性,更換試劑時(shí)應(yīng)進(jìn)行必要的鑒定,必要時(shí)對(duì)測(cè)定方法要做重復(fù)性試驗(yàn)和回收試驗(yàn)。
5.建立可靠的檢查制度。經(jīng)常對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行核查,利用控制血清、標(biāo)準(zhǔn)血清檢查每批結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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