（一）制片
選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通優(yōu)質(zhì)玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙醚等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。

（二）固定

除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的作用有三：①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標本易于保存，如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不改變其染色特性。

標本的固定原則是：①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；②不能凝集蛋白質(zhì)；③不能損傷細胞形態(tài)；④固定后應(yīng)保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結(jié)合。

表 常用抗原物質(zhì)的固定方法

（三）水洗

固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。

（四）染色

染色分直接染色法與間接染色法。

1． 材料與試劑

（1）熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度。

（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液

（3）9份優(yōu)質(zhì)甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

（4）帶蓋方盤

2．直接染色法

（1）將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30 min～45min。

（2）PBS沖洗3次，每次沖洗3min，即3×3ˊ沖洗。

（3）蒸餾水沖洗。

（4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

2． 間接染色法

（1） 檢查抗原：①取固定標本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ沖洗；③再加熒光標記的抗抗體，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ沖洗；⑤H2O沖洗，涼干；⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

（2） 檢查抗體：①以免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相應(yīng)抗原液（按1﹕100～1﹕500稀釋），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ沖洗；④加熒光抗體，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ沖洗；⑥水洗，涼干；⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

（五）結(jié)果顯示

熒光顯微鏡所觀察到的圖象，主要以兩個指標判斷結(jié)果，一個是形態(tài)學(xué)特征；另一個是熒光的亮度，在結(jié)果的判定中，必須將二者結(jié)合起來，綜合判定。

熒光強度的表示方法如下：

＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色。

＋＋ ：熒光明亮，呈黃綠色。

＋ ：熒光較弱，但清楚可見。

± ：極弱的可疑熒光。

－ ：無熒光。

（六）標本保存

由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。

保存的方法可采取以下幾種：①固定標本片以后低溫保存，隨用隨染；②染色片采取優(yōu)質(zhì)封固劑，如特別的熒光封固劑（Fluormount）或堿性優(yōu)質(zhì)純甘油固劑等封固。這些封固劑能防止熒光激發(fā)，封固后低溫保存；④可以采用拍照保存照片。