（一）免疫球蛋白的提取
（二） 熒光素
1． 熒光色素的基本條件
（1） 具有化學(xué)活性基團(tuán)，如異硫氰基（-NCS）等，易與免疫球蛋白結(jié)合形成共價(jià)鍵。
（2） 對(duì)免疫球蛋白無毒性，不影響抗體活性。
（3） 熒光效應(yīng)高，與蛋白結(jié)合需要量少。
（4） 熒光素性能穩(wěn)定，結(jié)合物性能穩(wěn)定，容易貯藏。
（5） 結(jié)合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。
到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。
2．常用的熒光色素
（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分有結(jié)晶型與粉末型兩種,結(jié)晶型熒光強(qiáng)度大、穩(wěn)定、優(yōu)于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長(zhǎng)為495nm。最大發(fā)射波長(zhǎng)520nm。異硫氰酸熒光黃性質(zhì)穩(wěn)定，于低溫下可保存二年以上，但久置標(biāo)記抗體能力弱，熒光亮度差，故應(yīng)采用新產(chǎn)品。
異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結(jié)合。一個(gè)IgG分子有86個(gè)氨基酸殘基，一般最多能標(biāo)記16～20個(gè)熒光素分子。
（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長(zhǎng)570nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為600nm。
由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨(dú)使用，多用于與FITC標(biāo)記抗體的反襯染色或雙標(biāo)記配合使用。此染料不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染料的-SO3Na基變?yōu)?SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的硫氨鍵。
（三） 標(biāo)記方法
異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種：
1． 攪拌法
（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。
（2）按熒光素與蛋白質(zhì)比1︰20～1︰100（一般用1︰100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。
（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動(dòng)開關(guān)，輕輕攪拌，以不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液（約10min～15min加完）。加完后，隨時(shí)用試紙測(cè)定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4℃攪拌6h～12h即可。
2． 透析法
（1）將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。
（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4℃攪拌24即可。
透析法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記均勻，非特異性熒光少，但所標(biāo)記的時(shí)間長(zhǎng)，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。
3．影響標(biāo)記的因素
（1）熒光素與蛋白質(zhì)的比值：這也取決于熒光素的質(zhì)量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白質(zhì)為宜，而結(jié)晶型則只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白質(zhì)即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml為宜，濃度過低標(biāo)記過慢。濃度過高，標(biāo)記效果不好。不過在實(shí)踐中，以稍高一些蛋白濃度為好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5為最好。過低標(biāo)記速度慢，過高蛋白質(zhì)容易變性。
（3）溫度和時(shí)間：溫度4℃～25℃均可。溫度與時(shí)間是成正比的，溫度低，反應(yīng)慢，溫度高，反應(yīng)快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。實(shí)踐中可自選。透析法還是以4℃較長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)為好。
（4）熒光素的質(zhì)量及有效期。
（四）標(biāo)記抗體的純化
標(biāo)記后溶液是一個(gè)混合體，它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體，還有游離的熒光素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過多的蛋白質(zhì)。對(duì)于某些細(xì)菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對(duì)于一般組織染色熒光抗體，則要去除過度標(biāo)記的抗體即可。只是對(duì)某些特殊要求的組織染色試劑，則必須經(jīng)過仔細(xì)的處理，包括具有特異性交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)性的除去。
1． 去除游離的熒光素
（1）透析法：將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4℃透析數(shù)天，每天換液數(shù)次，直至透析液中無游離色素為止。通常約需5～7天才能透析完畢。
（2）凝膠過濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進(jìn)行過濾。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，讓大部分游離熒光素除去，再過G25或G50柱。
2． 去除過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子 可采用DEAE—纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進(jìn)行，具體方法如下：
（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。
（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。
（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。
（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。
收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測(cè)熒光素的OD值，再于280nm測(cè)蛋白的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度，并計(jì)算出F/P比值（見后介紹），將合格者合并，濃縮后分裝小瓶備用。
層析柱上滯留的過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。
3．去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)取？梢砸耘K粉進(jìn)行吸收。具體做法如下：于每ml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標(biāo)記抗體。必要時(shí)可減半臟粉用量再處理一次。
經(jīng)過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因?yàn)橹亟饘賹?duì)熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。
（五）標(biāo)記抗體的鑒定
1．F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結(jié)合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
異硫氰酸熒光素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的濃度，在495nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值，按重量與OD值在坐標(biāo)上制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml，在280nm測(cè)其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計(jì)算F/P比值：
1．6× 104 FITCμg/ml FITCμg/ml
F/P（克分子比值）= × =0.41 ×
390 抗體mg/ml 抗體mg/ml
式中1·6×104為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。
F/P克分子比值以1～2為合適，1～3.5為合格。比值過低敏感性差，比值過高，易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。用于檢查組織細(xì)胞抗原成分，F(xiàn)/P以1～2為好；用于檢查細(xì)菌涂片時(shí)，F(xiàn)/P以2～3為好。
2． 免疫電泳測(cè)定 通過免疫電泳可以測(cè)定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現(xiàn)一條沉淀線。
3．染色性能的鑒定 包括測(cè)定熒光抗體的敏感性與特異性。
（1）熒光抗體效價(jià)的測(cè)定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“ ”熒光強(qiáng)度的最大稀釋倍數(shù)即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實(shí)際應(yīng)用時(shí)則取2個(gè)或3個(gè)單位做應(yīng)用的稀釋度。
（2）熒光抗體的特異性試驗(yàn)：為了確保熒光抗體的特異性，必須預(yù)先進(jìn)行下列試驗(yàn)。①陽性標(biāo)本染色試驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的相應(yīng)的抗原，結(jié)果應(yīng)是陽性；②陰性標(biāo)本染色試驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應(yīng)抗原，結(jié)果應(yīng)是陰性；③類屬性抗原染色試驗(yàn)：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應(yīng)為陰性，說明特異性強(qiáng)，如不同程度地出現(xiàn)有熒光，說明具有類屬反應(yīng)，特異性不強(qiáng)等；④抗體吸收試驗(yàn)：以過量的相應(yīng)抗原加入熒光抗體中，感作2h~4h，4℃過夜，離心取上清再對(duì)相應(yīng)抗原染色，應(yīng)無熒光或熒光顯著消退；⑤染色阻抑試驗(yàn)：用未標(biāo)記的抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，沖洗后，再用熒光抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，結(jié)果觀察，應(yīng)無熒光。阻抑試驗(yàn)應(yīng)注意抗體與抗原的相應(yīng)比例，未標(biāo)記抗體的比例過小，結(jié)果抗原結(jié)合有剩余，標(biāo)記抗體仍能被結(jié)合而顯示出阻抑不全。當(dāng)抗體比例過大，則抗體的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)結(jié)合而表現(xiàn)出不牢固，極易被標(biāo)記抗體所置換出來而又顯示出阻抑不全。
（二） 熒光素
1． 熒光色素的基本條件
（1） 具有化學(xué)活性基團(tuán)，如異硫氰基（-NCS）等，易與免疫球蛋白結(jié)合形成共價(jià)鍵。
（2） 對(duì)免疫球蛋白無毒性，不影響抗體活性。
（3） 熒光效應(yīng)高，與蛋白結(jié)合需要量少。
（4） 熒光素性能穩(wěn)定，結(jié)合物性能穩(wěn)定，容易貯藏。
（5） 結(jié)合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。
到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。
2．常用的熒光色素
（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分有結(jié)晶型與粉末型兩種,結(jié)晶型熒光強(qiáng)度大、穩(wěn)定、優(yōu)于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長(zhǎng)為495nm。最大發(fā)射波長(zhǎng)520nm。異硫氰酸熒光黃性質(zhì)穩(wěn)定，于低溫下可保存二年以上，但久置標(biāo)記抗體能力弱，熒光亮度差，故應(yīng)采用新產(chǎn)品。
異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結(jié)合。一個(gè)IgG分子有86個(gè)氨基酸殘基，一般最多能標(biāo)記16～20個(gè)熒光素分子。
（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長(zhǎng)570nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為600nm。
由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨(dú)使用，多用于與FITC標(biāo)記抗體的反襯染色或雙標(biāo)記配合使用。此染料不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染料的-SO3Na基變?yōu)?SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的硫氨鍵。
（三） 標(biāo)記方法
異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種：
1． 攪拌法
（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。
（2）按熒光素與蛋白質(zhì)比1︰20～1︰100（一般用1︰100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。
（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動(dòng)開關(guān)，輕輕攪拌，以不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液（約10min～15min加完）。加完后，隨時(shí)用試紙測(cè)定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4℃攪拌6h～12h即可。
2． 透析法
（1）將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。
（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4℃攪拌24即可。
透析法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記均勻，非特異性熒光少，但所標(biāo)記的時(shí)間長(zhǎng)，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。
3．影響標(biāo)記的因素
（1）熒光素與蛋白質(zhì)的比值：這也取決于熒光素的質(zhì)量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白質(zhì)為宜，而結(jié)晶型則只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白質(zhì)即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml為宜，濃度過低標(biāo)記過慢。濃度過高，標(biāo)記效果不好。不過在實(shí)踐中，以稍高一些蛋白濃度為好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5為最好。過低標(biāo)記速度慢，過高蛋白質(zhì)容易變性。
（3）溫度和時(shí)間：溫度4℃～25℃均可。溫度與時(shí)間是成正比的，溫度低，反應(yīng)慢，溫度高，反應(yīng)快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。實(shí)踐中可自選。透析法還是以4℃較長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)為好。
（4）熒光素的質(zhì)量及有效期。
（四）標(biāo)記抗體的純化
標(biāo)記后溶液是一個(gè)混合體，它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體，還有游離的熒光素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過多的蛋白質(zhì)。對(duì)于某些細(xì)菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對(duì)于一般組織染色熒光抗體，則要去除過度標(biāo)記的抗體即可。只是對(duì)某些特殊要求的組織染色試劑，則必須經(jīng)過仔細(xì)的處理，包括具有特異性交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)性的除去。
1． 去除游離的熒光素
（1）透析法：將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4℃透析數(shù)天，每天換液數(shù)次，直至透析液中無游離色素為止。通常約需5～7天才能透析完畢。
（2）凝膠過濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進(jìn)行過濾。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，讓大部分游離熒光素除去，再過G25或G50柱。
2． 去除過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子 可采用DEAE—纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進(jìn)行，具體方法如下：
（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。
（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。
（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。
（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。
收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測(cè)熒光素的OD值，再于280nm測(cè)蛋白的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度，并計(jì)算出F/P比值（見后介紹），將合格者合并，濃縮后分裝小瓶備用。
層析柱上滯留的過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。
3．去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)取？梢砸耘K粉進(jìn)行吸收。具體做法如下：于每ml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標(biāo)記抗體。必要時(shí)可減半臟粉用量再處理一次。
經(jīng)過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因?yàn)橹亟饘賹?duì)熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。
（五）標(biāo)記抗體的鑒定
1．F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結(jié)合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
異硫氰酸熒光素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的濃度，在495nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值，按重量與OD值在坐標(biāo)上制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml，在280nm測(cè)其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計(jì)算F/P比值：
1．6× 104 FITCμg/ml FITCμg/ml
F/P（克分子比值）= × =0.41 ×
390 抗體mg/ml 抗體mg/ml
式中1·6×104為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。
F/P克分子比值以1～2為合適，1～3.5為合格。比值過低敏感性差，比值過高，易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。用于檢查組織細(xì)胞抗原成分，F(xiàn)/P以1～2為好；用于檢查細(xì)菌涂片時(shí)，F(xiàn)/P以2～3為好。
2． 免疫電泳測(cè)定 通過免疫電泳可以測(cè)定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現(xiàn)一條沉淀線。
3．染色性能的鑒定 包括測(cè)定熒光抗體的敏感性與特異性。
（1）熒光抗體效價(jià)的測(cè)定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“ ”熒光強(qiáng)度的最大稀釋倍數(shù)即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實(shí)際應(yīng)用時(shí)則取2個(gè)或3個(gè)單位做應(yīng)用的稀釋度。
（2）熒光抗體的特異性試驗(yàn)：為了確保熒光抗體的特異性，必須預(yù)先進(jìn)行下列試驗(yàn)。①陽性標(biāo)本染色試驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的相應(yīng)的抗原，結(jié)果應(yīng)是陽性；②陰性標(biāo)本染色試驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應(yīng)抗原，結(jié)果應(yīng)是陰性；③類屬性抗原染色試驗(yàn)：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應(yīng)為陰性，說明特異性強(qiáng)，如不同程度地出現(xiàn)有熒光，說明具有類屬反應(yīng)，特異性不強(qiáng)等；④抗體吸收試驗(yàn)：以過量的相應(yīng)抗原加入熒光抗體中，感作2h~4h，4℃過夜，離心取上清再對(duì)相應(yīng)抗原染色，應(yīng)無熒光或熒光顯著消退；⑤染色阻抑試驗(yàn)：用未標(biāo)記的抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，沖洗后，再用熒光抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，結(jié)果觀察，應(yīng)無熒光。阻抑試驗(yàn)應(yīng)注意抗體與抗原的相應(yīng)比例，未標(biāo)記抗體的比例過小，結(jié)果抗原結(jié)合有剩余，標(biāo)記抗體仍能被結(jié)合而顯示出阻抑不全。當(dāng)抗體比例過大，則抗體的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)結(jié)合而表現(xiàn)出不牢固，極易被標(biāo)記抗體所置換出來而又顯示出阻抑不全。