1、染色過強(qiáng)
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原因 |
解決辦法 |
| 抗體的濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長 | 降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4℃過夜 |
| 孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃ | 一般室溫20-28℃ |
| DAB顯色時(shí)間過長或DAB濃度過高 | 顯色時(shí)間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn) |
2、非特異性背景染色
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原因 |
解決辦法 |
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操作過程中沖洗不充分 |
每步?jīng)_洗3×5 |
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組織中含過氧化物酶未阻斷 |
可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時(shí)間延長 |
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組織中含內(nèi)源性生物素 |
正常非免疫動(dòng)物血清再封閉 |
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血清蛋白封閉不充分 |
延長血清蛋白封閉時(shí)間 |
3、染色弱
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原因 |
解決辦法 |
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抗體濃度過低，孵育時(shí)間過短 |
提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘 |
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試劑超過有效使用期 |
及時(shí)更換試劑 |
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操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋 |
每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥） |
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室溫太低，低于15℃ |
若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過夜） |
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蛋白封閉過度 |
封閉時(shí)間不要超過10分鐘 |
4、染色陰性
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原因 |
解決辦法 |
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操作步驟錯(cuò)誤 |
重新試驗(yàn)，設(shè)立陽性對照 |
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組織中無抗原 |
設(shè)立陽性對照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤 | 仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤 |