基因是染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長(zhǎng)度的核苷酸序列。植物的生長(zhǎng)發(fā)育是在多種代謝和生理過(guò)程基礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時(shí)空上表達(dá)的綜合現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)和分離潛在的各種有價(jià)值的基因并深入研究其表達(dá)機(jī)理，對(duì)作物品種的改良具有重要意義。因此對(duì)植物基因的克隆并發(fā)展與之相關(guān)的技術(shù)已引起人們的日益關(guān)注和投入，近年來(lái)其研究方法不斷改進(jìn)，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這為進(jìn)一步研究諸如各種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的基因、逆境與防御反應(yīng)的基因、植物細(xì)胞凋亡的基因等提供了新的途徑。
一、常用的目的基因克隆技術(shù)
1、通過(guò)已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定
這類(lèi)技術(shù)主要通過(guò)生物化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸順序進(jìn)行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過(guò)抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選來(lái)分離目的基因。如植物抗病蟲(chóng)基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當(dāng)其他植物的同類(lèi)基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時(shí)，也可直接用這些已知的基因片段作探針對(duì)未克隆到該基因的植物基因文庫(kù)進(jìn)行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過(guò)遺傳表型分析
（1）基因標(biāo)鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對(duì)突變體文庫(kù)進(jìn)行篩選，以選到的陽(yáng)性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫(kù)分離目的基因。如將一株帶有功能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導(dǎo)致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫(kù)，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探針，從該文庫(kù)中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚(yú)草等。應(yīng)用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關(guān)的Viviparious-1基因及與金魚(yú)草花發(fā)育有關(guān)的一些基因等。
（2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該技術(shù)是利用病菌無(wú)毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關(guān)系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質(zhì)抗病基因，如番茄與無(wú)毒基因avr9對(duì)應(yīng)的抗病基因cf9，與avrPto對(duì)應(yīng)的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對(duì)應(yīng)的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)
以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記如RFLP等為起點(diǎn)，通過(guò)染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷(xiāo)標(biāo)記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（3）構(gòu)建YAC文庫(kù)，找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆，并通過(guò)克隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段；（4）通過(guò)轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)基因所在的DNA片段。如用該技術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲(chóng)mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPM1基因等。
二、發(fā)展中的基因克隆新技術(shù)
1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因
（1）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個(gè)DNA片段的差異，通過(guò)將大量特殊標(biāo)記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當(dāng)溫度下復(fù)性，待反應(yīng)體系中的單鏈DNA重新配對(duì)成雙鏈后，除去標(biāo)記的突變體DNA和與之雜交配對(duì)的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應(yīng)體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對(duì)親本特異DNA片段進(jìn)行克隆。
(2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶處理的未缺失親本DNA（備測(cè)DNA）與大量經(jīng)超聲波切割、光敏生物素標(biāo)記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經(jīng)變性復(fù)性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經(jīng)幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后PCR產(chǎn)物直接克隆或32P標(biāo)記后作探針與親本DNA或核DNA文庫(kù)雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應(yīng)用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關(guān)的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導(dǎo)基因等。
2、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列
真核生物基因組DNA中只有很小一部分編碼mRNA，而大部分則為內(nèi)含子、外顯子和重復(fù)序列，目前通過(guò)大規(guī)�；蚪M測(cè)序來(lái)尋找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分離表達(dá)序列的方法中，cDNA捕捉法是較成功的一種方法，已用于許多基因的定位克隆。
�。╨）cDNA文庫(kù)差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達(dá)基因的方法，例如對(duì)于兩種不同的組織細(xì)胞，先提取它們的poly(A) mRNA，分別構(gòu)建這兩種組織的cDNA文庫(kù)，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標(biāo)記的cDNA探針，再用這兩種探針?lè)謩e與一類(lèi)cDNA文庫(kù)的兩套重復(fù)考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細(xì)胞中都表達(dá)的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA，再對(duì)這樣的克隆進(jìn)行測(cè)序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達(dá)的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達(dá)的基因。
(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一種以表達(dá)為基礎(chǔ)的基因分離技術(shù)。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉cDNA片段，從而達(dá)到快速地從大的基因組區(qū)域分離表達(dá)序列。其主要技術(shù)是用PCR擴(kuò)增來(lái)自不同組織的混合cDNA池或已克隆的cDNA文庫(kù)，擴(kuò)增的cDNA片段與用生物素隨機(jī)標(biāo)記的基因組目標(biāo)DNA雜交，捕獲親和素標(biāo)記磁珠上的與目標(biāo)DNA雜交的cDNA片段，然后洗脫磁缽上捕獲的cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行第二輪篩選，并將篩選出的cDNA片段克隆到載體上。
3、通過(guò)研究mRNA差異表達(dá)篩選克隆基因
1992年粱鵬等在mRNA差異表達(dá)通用方法即mRNA差減雜交技術(shù)基礎(chǔ)上建立了mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(DDRT-PCR)，由于該技術(shù)所存在的缺陷和不足，已有許多研究在引物設(shè)計(jì)、Northern雜交和凝膠測(cè)序等方面對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，已發(fā)展了許多衍生的新技術(shù)，如用隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增RNA指紋分析(RAP)、順次差異顯示法(ODD)、基因組差異顯示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
mRNA的差異顯示法已在發(fā)育和生理過(guò)程中差異表達(dá)基因的克隆方面得到廣泛的應(yīng)用，特別適用于進(jìn)行數(shù)種平行材料之間的比較篩選。應(yīng)用RC4D法可分析植物發(fā)育過(guò)程中某一組織的某一特定多基因家族不同成員的差異表達(dá)，如已從玉米花序中分離出6個(gè)雌雄花序中差異表達(dá)的MAD-box基因，從小麥和擬南芥中分別分離出HSP家族基因。
4、表型克隆法
表型克隆法是以mRNA為起始材料，利用RT-PCR和接頭技術(shù)，對(duì)差異顯示的基因帶紋進(jìn)行回收后作探針，在cDNA或基因組DNA文庫(kù)中掃描篩選新的基因。這方面最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)主要有：cDNA差式分析法(RDA)、標(biāo)簽接頭競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)（ATAC一PCR）、抑制消減雜交法(SSH)、基因表達(dá)連續(xù)分析法(SAGE)、cDNA3端限制酶切片段顯示法(RFD)等，這些技術(shù)省去了分子標(biāo)記定位分析的繁瑣程序，并同時(shí)能分離多個(gè)未知產(chǎn)物的差異表達(dá)基因。
5、應(yīng)用DNA芯片技術(shù)篩選新基因
DNA芯片技術(shù)是利用核酸雜交原理檢測(cè)未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，以預(yù)先設(shè)計(jì)排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成生物集成膜片，與不同標(biāo)記的游離靶分子（DNA 或RNA）雜交，或生物集成膜片上的不同靶分子與游離的探針雜交，然后應(yīng)用熒光信號(hào)檢測(cè)器及處理器根據(jù)雜交分子或未雜交分子所發(fā)出的不同波長(zhǎng)的光檢測(cè)雜交信號(hào)。如完全雜交則發(fā)出強(qiáng)的熒光信號(hào)或特殊波長(zhǎng)信號(hào)，不完全雜交信號(hào)較弱，若不能雜交則檢測(cè)不到熒光信號(hào)或只檢測(cè)到芯片上原有熒光信號(hào)。這些不同區(qū)域的熒光信號(hào)在芯片上組成熒光分布譜型，可被激光共聚焦顯微鏡激發(fā)和檢測(cè)，經(jīng)電腦軟件處理檢出DNA的序列及其變化。例如斯坦福大學(xué)從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中用PCR法擴(kuò)增插入基因，得到1046種未知序列擴(kuò)增產(chǎn)物，將這些擴(kuò)增產(chǎn)物作為靶DNA點(diǎn)樣到經(jīng)包被的玻片上，制成DNA芯片，經(jīng)SDS、NaBH4等處理，95℃熱變性后分別與熱擊T細(xì)胞及未處理T細(xì)胞的cDNA雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，其余6個(gè)是被熱擊抑制的，經(jīng)序列分析表明其中3個(gè)為未發(fā)現(xiàn)的新基因。植物上最近已有應(yīng)用cDNA芯片對(duì)草莓、矮牽牛進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。
DNA芯片技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個(gè)基因在不同時(shí)空表達(dá)方面是一項(xiàng)十分有用的技術(shù)，已有學(xué)者對(duì)其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用作了展望，如應(yīng)用DNA芯片技術(shù)有望更深入地了解植物生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)在機(jī)制、植物生長(zhǎng)激素的作用機(jī)制、轉(zhuǎn)基因工程株的實(shí)驗(yàn)室快速分析、了解小分子對(duì)基因表達(dá)的影響及加速DNA多態(tài)性的檢測(cè)等。
綜上所述的各種植物未知基因分離克隆技術(shù)，其研究和分析對(duì)象各有側(cè)重且各有優(yōu)缺點(diǎn)，有的在植物基因資源的研究開(kāi)發(fā)上應(yīng)用比較成熟，有的正逐漸應(yīng)用到植物上。毫無(wú)疑問(wèn)，發(fā)展中的這些植物基因分離技術(shù)在植物的分子生物學(xué)和基因工程中有著巨大的應(yīng)用潛能，隨著新的基因資源的不斷發(fā)掘，作物的許多性狀諸如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性，植株的形態(tài)、熟期、花器發(fā)育的調(diào)節(jié)，以及一些復(fù)雜的生理生化性狀等都可望得到進(jìn)一步的改良。
一、常用的目的基因克隆技術(shù)
1、通過(guò)已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定
這類(lèi)技術(shù)主要通過(guò)生物化學(xué)和病理學(xué)研究分離鑒定有關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸順序進(jìn)行分析，推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過(guò)抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選來(lái)分離目的基因。如植物抗病蟲(chóng)基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當(dāng)其他植物的同類(lèi)基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時(shí)，也可直接用這些已知的基因片段作探針對(duì)未克隆到該基因的植物基因文庫(kù)進(jìn)行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過(guò)遺傳表型分析
（1）基因標(biāo)鑒法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對(duì)突變體文庫(kù)進(jìn)行篩選，以選到的陽(yáng)性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫(kù)分離目的基因。如將一株帶有功能的轉(zhuǎn)位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉(zhuǎn)位因子插入到某一特定基因序列中導(dǎo)致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構(gòu)建基因文庫(kù)，然后將轉(zhuǎn)位因子用同位素標(biāo)記作探針，從該文庫(kù)中篩選出帶有同源轉(zhuǎn)位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚(yú)草等。應(yīng)用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關(guān)的Viviparious-1基因及與金魚(yú)草花發(fā)育有關(guān)的一些基因等。
（2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術(shù)。該技術(shù)是利用病菌無(wú)毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關(guān)系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質(zhì)抗病基因，如番茄與無(wú)毒基因avr9對(duì)應(yīng)的抗病基因cf9，與avrPto對(duì)應(yīng)的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對(duì)應(yīng)的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)
以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記如RFLP等為起點(diǎn)，通過(guò)染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標(biāo)基因定位在高密度的分子標(biāo)記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷(xiāo)標(biāo)記的遺傳圖譜距轉(zhuǎn)換成物理距離；（3）構(gòu)建YAC文庫(kù)，找到含連鎖標(biāo)記的YAC克隆，并通過(guò)克隆的排序獲得目標(biāo)基因的DNA片段；（4）通過(guò)轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)基因所在的DNA片段。如用該技術(shù)已分離出番茄抗根結(jié)線蟲(chóng)mi基因和擬南芥菜抗細(xì)菌性莖腐病的RPM1基因等。
二、發(fā)展中的基因克隆新技術(shù)
1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因
（1）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個(gè)DNA片段的差異，通過(guò)將大量特殊標(biāo)記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當(dāng)溫度下復(fù)性，待反應(yīng)體系中的單鏈DNA重新配對(duì)成雙鏈后，除去標(biāo)記的突變體DNA和與之雜交配對(duì)的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應(yīng)體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對(duì)親本特異DNA片段進(jìn)行克隆。
(2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶處理的未缺失親本DNA（備測(cè)DNA）與大量經(jīng)超聲波切割、光敏生物素標(biāo)記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經(jīng)變性復(fù)性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經(jīng)幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后PCR產(chǎn)物直接克隆或32P標(biāo)記后作探針與親本DNA或核DNA文庫(kù)雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應(yīng)用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關(guān)的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導(dǎo)基因等。
2、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列
真核生物基因組DNA中只有很小一部分編碼mRNA，而大部分則為內(nèi)含子、外顯子和重復(fù)序列，目前通過(guò)大規(guī)�；蚪M測(cè)序來(lái)尋找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分離表達(dá)序列的方法中，cDNA捕捉法是較成功的一種方法，已用于許多基因的定位克隆。
�。╨）cDNA文庫(kù)差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達(dá)基因的方法，例如對(duì)于兩種不同的組織細(xì)胞，先提取它們的poly(A) mRNA，分別構(gòu)建這兩種組織的cDNA文庫(kù)，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標(biāo)記的cDNA探針，再用這兩種探針?lè)謩e與一類(lèi)cDNA文庫(kù)的兩套重復(fù)考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細(xì)胞中都表達(dá)的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細(xì)胞中特異表達(dá)的mRNA，再對(duì)這樣的克隆進(jìn)行測(cè)序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達(dá)的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達(dá)的基因。
(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一種以表達(dá)為基礎(chǔ)的基因分離技術(shù)。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉cDNA片段，從而達(dá)到快速地從大的基因組區(qū)域分離表達(dá)序列。其主要技術(shù)是用PCR擴(kuò)增來(lái)自不同組織的混合cDNA池或已克隆的cDNA文庫(kù)，擴(kuò)增的cDNA片段與用生物素隨機(jī)標(biāo)記的基因組目標(biāo)DNA雜交，捕獲親和素標(biāo)記磁珠上的與目標(biāo)DNA雜交的cDNA片段，然后洗脫磁缽上捕獲的cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行第二輪篩選，并將篩選出的cDNA片段克隆到載體上。
3、通過(guò)研究mRNA差異表達(dá)篩選克隆基因
1992年粱鵬等在mRNA差異表達(dá)通用方法即mRNA差減雜交技術(shù)基礎(chǔ)上建立了mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(DDRT-PCR)，由于該技術(shù)所存在的缺陷和不足，已有許多研究在引物設(shè)計(jì)、Northern雜交和凝膠測(cè)序等方面對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，已發(fā)展了許多衍生的新技術(shù)，如用隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增RNA指紋分析(RAP)、順次差異顯示法(ODD)、基因組差異顯示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
mRNA的差異顯示法已在發(fā)育和生理過(guò)程中差異表達(dá)基因的克隆方面得到廣泛的應(yīng)用，特別適用于進(jìn)行數(shù)種平行材料之間的比較篩選。應(yīng)用RC4D法可分析植物發(fā)育過(guò)程中某一組織的某一特定多基因家族不同成員的差異表達(dá)，如已從玉米花序中分離出6個(gè)雌雄花序中差異表達(dá)的MAD-box基因，從小麥和擬南芥中分別分離出HSP家族基因。
4、表型克隆法
表型克隆法是以mRNA為起始材料，利用RT-PCR和接頭技術(shù)，對(duì)差異顯示的基因帶紋進(jìn)行回收后作探針，在cDNA或基因組DNA文庫(kù)中掃描篩選新的基因。這方面最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)主要有：cDNA差式分析法(RDA)、標(biāo)簽接頭競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)（ATAC一PCR）、抑制消減雜交法(SSH)、基因表達(dá)連續(xù)分析法(SAGE)、cDNA3端限制酶切片段顯示法(RFD)等，這些技術(shù)省去了分子標(biāo)記定位分析的繁瑣程序，并同時(shí)能分離多個(gè)未知產(chǎn)物的差異表達(dá)基因。
5、應(yīng)用DNA芯片技術(shù)篩選新基因
DNA芯片技術(shù)是利用核酸雜交原理檢測(cè)未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，以預(yù)先設(shè)計(jì)排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成生物集成膜片，與不同標(biāo)記的游離靶分子（DNA 或RNA）雜交，或生物集成膜片上的不同靶分子與游離的探針雜交，然后應(yīng)用熒光信號(hào)檢測(cè)器及處理器根據(jù)雜交分子或未雜交分子所發(fā)出的不同波長(zhǎng)的光檢測(cè)雜交信號(hào)。如完全雜交則發(fā)出強(qiáng)的熒光信號(hào)或特殊波長(zhǎng)信號(hào)，不完全雜交信號(hào)較弱，若不能雜交則檢測(cè)不到熒光信號(hào)或只檢測(cè)到芯片上原有熒光信號(hào)。這些不同區(qū)域的熒光信號(hào)在芯片上組成熒光分布譜型，可被激光共聚焦顯微鏡激發(fā)和檢測(cè)，經(jīng)電腦軟件處理檢出DNA的序列及其變化。例如斯坦福大學(xué)從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中用PCR法擴(kuò)增插入基因，得到1046種未知序列擴(kuò)增產(chǎn)物，將這些擴(kuò)增產(chǎn)物作為靶DNA點(diǎn)樣到經(jīng)包被的玻片上，制成DNA芯片，經(jīng)SDS、NaBH4等處理，95℃熱變性后分別與熱擊T細(xì)胞及未處理T細(xì)胞的cDNA雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，其余6個(gè)是被熱擊抑制的，經(jīng)序列分析表明其中3個(gè)為未發(fā)現(xiàn)的新基因。植物上最近已有應(yīng)用cDNA芯片對(duì)草莓、矮牽牛進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。
DNA芯片技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個(gè)基因在不同時(shí)空表達(dá)方面是一項(xiàng)十分有用的技術(shù)，已有學(xué)者對(duì)其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用作了展望，如應(yīng)用DNA芯片技術(shù)有望更深入地了解植物生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)在機(jī)制、植物生長(zhǎng)激素的作用機(jī)制、轉(zhuǎn)基因工程株的實(shí)驗(yàn)室快速分析、了解小分子對(duì)基因表達(dá)的影響及加速DNA多態(tài)性的檢測(cè)等。
綜上所述的各種植物未知基因分離克隆技術(shù)，其研究和分析對(duì)象各有側(cè)重且各有優(yōu)缺點(diǎn)，有的在植物基因資源的研究開(kāi)發(fā)上應(yīng)用比較成熟，有的正逐漸應(yīng)用到植物上。毫無(wú)疑問(wèn)，發(fā)展中的這些植物基因分離技術(shù)在植物的分子生物學(xué)和基因工程中有著巨大的應(yīng)用潛能，隨著新的基因資源的不斷發(fā)掘，作物的許多性狀諸如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性，植株的形態(tài)、熟期、花器發(fā)育的調(diào)節(jié)，以及一些復(fù)雜的生理生化性狀等都可望得到進(jìn)一步的改良。
