純化問題所涉及的具體步驟最終取決于樣品的性質(zhì)。但也有共同可參考的階段
捕獲階段：目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。
中度純化階段：目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。
精制階段：除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。
分離方法的選擇
根據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)采用不同的分離方法：
捕獲階段：目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。
中度純化階段：目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。
精制階段：除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。
分離方法的選擇
根據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)采用不同的分離方法：
|
蛋白質(zhì)的性質(zhì)
|
方法
|
|
電荷（等電點）
|
離子交換（IEX）
|
|
分子量
|
凝膠過濾（GF）
|
|
疏水性
|
疏水（HIC）反相（RPC）
|
|
特異性結(jié)合
|
親和（AC）
|
每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡。
分辨率：由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來實現(xiàn)�？偟膩碚f，當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白性質(zhì)相似時，在純化的最后階段分辨率是重要因素。
處理量：一般指在純化過程中目標(biāo)蛋白的上樣量。如上樣體積、濃度等。
速度：在初純化中是重要因素，此時雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快除去。
回收率：隨著純化的進(jìn)行漸趨重要，因為純化產(chǎn)物的價值在增加。
在三階段純化策略中每一種方法的適用性見下表：
|
技術(shù)
|
主要特點
|
捕獲
|
中度純化
|
精制
|
樣品起始狀態(tài)
|
樣品最終狀態(tài)
|
|
IEX
|
高分辨率
高容量
高速度
|
★★★
|
★★★
|
★★★
|
低離子強(qiáng)度
樣品體積不限
|
高離子強(qiáng)度或pH改變。
樣品濃縮
|
|
HIC
|
分辨率好
容量好
高速度
|
★★
|
★★★
|
★
|
高離子強(qiáng)度
樣品體積不限
|
低離子強(qiáng)度
樣品濃縮
|
|
AC
|
高分辨率
高容量
高速度
|
★★★
|
★★★
|
★★
|
結(jié)合條件特殊
樣品體積不限
|
洗脫條件特殊
樣品濃縮
|
|
GF
|
高分辨率
（使用Supedex）
|
★
|
★★★
|
樣品體積（<總柱體積的5%）和流速范圍有限制
|
緩沖液更換（如果需要）
樣品稀釋
|
|
|
RPC
|
高分辨率
|
★
|
★★★
|
需要有機(jī)溶劑
|
在有機(jī)溶劑中，有損失生物活性的風(fēng)險
|
提示：
1、 通過組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至最少，以避免需要調(diào)節(jié)樣品。第一個步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜于下一個步驟的起始條件。
2、 硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法，所以HIC是捕獲階段的理想方法。
3、 GF很適宜在由濃縮效應(yīng)的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝膠過濾對上樣體積有限制，但不受緩沖液條件的影響。
4、 在捕獲階段選擇對目標(biāo)蛋白具有最高選擇性或／和處理量的方法
5、 如果對目標(biāo)蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下，可采用IEX-HIC-GF的方法組合作為標(biāo)準(zhǔn)方案。
6、 只要目標(biāo)蛋白耐受的情況下，可以考慮采用RPC方法用于精制階段。
注：應(yīng)該指出，三階段純化策略不是說所有的策略都必須是三個純化步驟。所用的步驟數(shù)目取決于純度要求和蛋白的最終用途。
附：純化工藝路線
1、 通過組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至最少，以避免需要調(diào)節(jié)樣品。第一個步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜于下一個步驟的起始條件。
2、 硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法，所以HIC是捕獲階段的理想方法。
3、 GF很適宜在由濃縮效應(yīng)的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝膠過濾對上樣體積有限制，但不受緩沖液條件的影響。
4、 在捕獲階段選擇對目標(biāo)蛋白具有最高選擇性或／和處理量的方法
5、 如果對目標(biāo)蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下，可采用IEX-HIC-GF的方法組合作為標(biāo)準(zhǔn)方案。
6、 只要目標(biāo)蛋白耐受的情況下，可以考慮采用RPC方法用于精制階段。
注：應(yīng)該指出，三階段純化策略不是說所有的策略都必須是三個純化步驟。所用的步驟數(shù)目取決于純度要求和蛋白的最終用途。
附：純化工藝路線
