生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T(mén)信息科學(xué)。最明顯的一個(gè)例子就是目前正在進(jìn)行的HGP（human genome project），最終要搞清人類(lèi)全部基因組的30億左右堿基對(duì)的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（model organism）已經(jīng)或正在被大規(guī)模測(cè)序，如大腸桿菌、啤酒酵母、秀麗隱桿線蟲(chóng)以及中國(guó)和日本科學(xué)家攻關(guān)的水稻基因組計(jì)劃。但單純知曉生物基因組序列一級(jí)結(jié)構(gòu)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還必須了解其中基因是怎樣組織起來(lái)的，每個(gè)基因的功能是什么，又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時(shí)空域中展開(kāi)其表達(dá)譜的，即我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問(wèn)題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)）[1]，涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測(cè)蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技術(shù)[2]。
一． 什么是基因芯片
生物芯片，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是在一塊指甲大小（1cm3）的有多聚賴(lài)氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針?lè)肿�，通常需包被以氨基硅烷或多聚�?lài)氨酸等）將生物分子探針（寡核苷酸片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行反應(yīng)的固相表面，在激光的順序激發(fā)下標(biāo)記熒光根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射譜征，CCD相機(jī)或激光共聚焦顯微鏡根據(jù)其波長(zhǎng)及波幅特征收集信號(hào)，作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交[3]的芯片。
基因芯片的基本原理同芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（sequencing by hybridization, SBH）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱(chēng)亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個(gè)8 nt亞序列：
(1) CTCATATG
(2) GCTCATAT
(3) AGCTCATA
(4) TAGCTCAT
(5) TTAGCTCA
這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中A、T、C、G 4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8 nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交�？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿膎體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶DNA 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。
二．芯片類(lèi)型
一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類(lèi)[4]
(一)元件型微陣列芯片
1生物電子芯片
2凝膠元件微陣列芯片
3藥物控釋芯片
(二) 通道型微陣列芯片
1毛細(xì)管電泳芯片
2 PCR擴(kuò)增芯片
3集成DNA分析芯片
4毛細(xì)管電層析芯片
(三)生物傳感芯片
1光學(xué)纖維陣列芯片
2白光干涉譜傳感芯片
小鼠基因表達(dá)譜芯片(MGEC)
附:目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種.(上海博星公司)
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芯片品種 |
芯片點(diǎn)數(shù) |
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MGEC-20S |
2000 |
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MGEC-40S |
4000 |
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MGEC-80S |
8000 |
癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片(CRGEC)
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分類(lèi) |
芯片型號(hào) |
芯片點(diǎn)數(shù) |
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肝癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 |
LiverC-16S |
1626 |
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LiverC-16D |
3252 |
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LiverC-9.5NS |
954 |
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LiverC-9.5ND |
1908 |
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肺癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 |
LungC-7.3S |
737 |
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LungC-7.3D |
1474 |
人類(lèi)基因表達(dá)譜芯片(HGEC)
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芯片品種 |
芯片點(diǎn)數(shù) |
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HGEC-10S |
1024 |
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HGEC-10D |
2048 |
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HGEC-20S |
2048 |
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HGEC-20D |
4096 |
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HGEC-40S |
4096 |
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HGEC-40D |
8192 |
|
HGEC-80S |
8192 |
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HGEC-80D |
16184 |
<![endif]>
三 基因芯片的制備
芯片種類(lèi)較多，制備方法也不盡相同，常見(jiàn)的芯片可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是原位合成；一種是直接點(diǎn)樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合成30nt左右，噴印法可以合成40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產(chǎn)率僅20%；噴印法可達(dá)99%以上，合成30nt產(chǎn)率可達(dá)74%，從這個(gè)意義上說(shuō)噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡(jiǎn)單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。
1 原位光蝕刻合成[5-7] 寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)4×n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò)32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。
目前美國(guó)Affymetrix公司已有同時(shí)檢測(cè)6,500個(gè)已知人類(lèi)基因的DNA芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類(lèi)基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約100萬(wàn)美元，目前產(chǎn)品尚未公開(kāi)投放市場(chǎng)發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益，但已有許多公司及研究機(jī)構(gòu)與其簽約購(gòu)買(mǎi)其產(chǎn)品。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開(kāi)發(fā)方面也具有誘人的前景。Affymetrix的大部分產(chǎn)品將在98年底全面投放市場(chǎng)。屆時(shí)，在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時(shí)，其所有的研究投入將變成巨大的利潤(rùn)。其它公司產(chǎn)品也正在從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究走向開(kāi)發(fā)應(yīng)用。目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測(cè)愛(ài)滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專(zhuān)業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：⑴對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；⑵開(kāi)發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。
另一方法是光導(dǎo)原位合成法。具體方法是在經(jīng)過(guò)處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類(lèi)及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長(zhǎng)的芯片需要4N個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針?lè)Q為一個(gè)“feature”，這樣的芯片便具有4N個(gè)“feature”，包含了全部長(zhǎng)度為N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無(wú)須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米，即探針間隔為 5－10μm，但只能制作II型 DNA芯片。見(jiàn)圖一。
2 原位噴印合成 芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類(lèi)似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。
3 點(diǎn)樣法 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。有的研究者用多聚賴(lài)氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類(lèi)PCR產(chǎn)物。有的研究者將玻片上覆蓋20μm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用機(jī)械刻寫(xiě)或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠，以實(shí)現(xiàn)DNA芯片分區(qū)，單元大小為 40×40μm或 100×100μm間隔分別為50μm和100μm。然后將化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針自動(dòng)化點(diǎn)樣于各個(gè)單元內(nèi)而制成DNA芯片，點(diǎn)樣速度可達(dá)2000單元/秒。
其裝置采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印/噴印針的打印/噴印頭；一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接打印時(shí)針頭與芯片接觸，而在噴印時(shí)針頭與芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常1平方厘米只有400點(diǎn)。國(guó)外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開(kāi)發(fā)打印/噴印設(shè)備，目前有一些已經(jīng)商品化。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印/噴印技術(shù)進(jìn)行生物芯片的研究和開(kāi)發(fā)，預(yù)計(jì)2年內(nèi)將有用于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品問(wèn)世。見(jiàn)圖二。
4 電子芯片[8-10] 電子芯片是由美國(guó)Ｎanogen公司開(kāi)發(fā)的，目前國(guó)內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開(kāi)發(fā)這一技術(shù)。這種芯片為帶有陽(yáng)電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成1mm×1mm的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過(guò)氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點(diǎn)是雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。制備復(fù)雜、成本高是其不足。
5 三維芯片[11-12] 三維芯片是由美國(guó)的Packard、摩托羅拉、Argonne國(guó)家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學(xué)研究所合作開(kāi)發(fā)的一種芯片技術(shù)。三維生物芯片實(shí)質(zhì)上是一塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個(gè)微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用于靶DNA，RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長(zhǎng)的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到0.2nl的體積打到凝膠上。以上幾家機(jī)構(gòu)合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一是凝膠的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再把樣品加到芯片上，因此需要進(jìn)行許多額外操作。本芯片所用凝膠體積很小。使PCR擴(kuò)增體系的體積減小1,000倍（總體積約納升級(jí)），從而節(jié)約了每個(gè)反應(yīng)所用的PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構(gòu)象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進(jìn)行免疫測(cè)定，受體-配體研究和蛋白組分析。
6 流過(guò)式芯片（flow-thru chip）[13] Cene Logic正在開(kāi)發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀微通道，Cene Logic設(shè)計(jì)及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測(cè)樣品中分離DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后，該樣品流過(guò)芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的核酸，采用Cene Logic's信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)分析結(jié)果。流通式芯片用于高通量分析已知基因的變化，其特定在于⑴敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增大，流過(guò)式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化；⑵速度快：微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間；⑶價(jià)格降低：由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡核苷酸吸附于微通道內(nèi)，使每一種流過(guò)芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。
四．基因芯片樣品制備
一般說(shuō)來(lái)應(yīng)用DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過(guò)程：生物學(xué)問(wèn)題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測(cè)；數(shù)據(jù)處理和建模。
1．樣品制備。一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3μg mRNA計(jì)算的
不同組織抽提3－10μg mRNA所需組織量
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器官/組織* |
提取3μgmRNA所需組織量(克) |
提取10μgmRNA所需織量(克) |
總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織] |
mRNA所占百分比[%] |
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成人正常組織 |
肝 |
0.2083 |
0.6944 |
1.80 - 1.80 mg/g |
0.80 |
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成人正常組織 |
腦 |
缺數(shù)據(jù) |
缺數(shù)據(jù) |
1.30 - 1.30 mg/g |
缺數(shù)據(jù) |
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成人正常組織 |
肺 |
0.3000 |
1.0000 |
1.00 - 1.00 mg/g |
1.00 |
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成人正常組織 |
心 |
0.5000 |
1.6667 |
0.60 - 0.60 mg/g |
1.00 |
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成人正常組織 |
胃 |
0.1852 |
0.6173 |
2.70 - 2.70 mg/g |
0.60 |
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成人正常組織 |
喉 |
0.3125 |
1.0417 |
1.20 - 1.20 mg/g |
0.80 |
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病理組織 |
結(jié)腸癌 |
0.2521 |
0.8403 |
1.70 - 1.70 mg/g |
0.70 |
|
病理組織 |
胃癌 |
0.4317 |
1.4388 |
0.50 - 0.50 mg/g |
1.39 |
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病理組織 |
空腸腺癌 |
0.3571 |
1.1905 |
1.40 - 1.40 mg/g |
0.60 |
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病理組織 |
直腸癌 |
0.1604 |
0.5348 |
1.70 - 1.70 mg/g |
1.10 |
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病理組織 |
肝癌 |
0.1116 |
0.3720 |
3.84 - 3.84 mg/g |
0.70 |
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病理組織 |
肺癌 |
0.1282 |
0.4274 |
2.00 - 2.00 mg/g |
1.17 |
<![endif]>
考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過(guò)程中的損失，客戶(hù)提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。
2 樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)．
組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程,(取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理要求 )
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鋁箔 |
經(jīng)DEPC水浸泡過(guò)夜，78°C烘干，高壓滅菌后烘干 |
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1.5 ml 微離心管 |
市場(chǎng)有售RNAase-Free的相應(yīng)規(guī)格離心管 |
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標(biāo)簽紙 |
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記號(hào)筆 |
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樣品登記表 |
由客戶(hù)指定專(zhuān)人填寫(xiě) |
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液氮罐 |
應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來(lái)源 |
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取材部位的病理切片 |
由客戶(hù)提供1-2張 |
注：
· 以下步驟1 － 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。
· 對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。
1 離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門(mén)部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）。
2在RNase-Free 0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。
3 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫(xiě)明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。
4 填寫(xiě)樣品登記表，寫(xiě)明樣品名稱(chēng)、種類(lèi)、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等
將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱(chēng)、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐
5 保留1-2張取材部位的病理切片。
五.生物芯片雜交
待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來(lái)源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無(wú)多大差異，只是采用的熒光素種類(lèi)更多，這可以滿(mǎn)足不同來(lái)源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。
雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來(lái)。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類(lèi)。如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。
此外，雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類(lèi)、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可使雜交效率提高150倍[9]。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（PNA）做探針[9]。雖然PNA的制備比較復(fù)雜，但與DNA探針比較有許多特點(diǎn)，如不需要鹽離子，因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。
六 基因芯片檢測(cè)原理
雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測(cè)分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。
由于所使用的標(biāo)記物不同，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也各具特色。大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo)記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測(cè)DNA化學(xué)發(fā)光。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定DNA芯片雜交譜型。
1．熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法
使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長(zhǎng)決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對(duì)象 以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過(guò)SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。
（1）激光掃描熒光顯微鏡
探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類(lèi)型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。
(2)激光掃描共焦顯微鏡
激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設(shè)計(jì)的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開(kāi)來(lái)是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號(hào)的同時(shí)，避開(kāi)樣品池中熒光信號(hào)的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來(lái)自樣品池的未雜交分子熒光信號(hào)，避免其對(duì)探測(cè)結(jié)果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用�，F(xiàn)在 Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12萬(wàn)美元。
（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡
這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測(cè)，因而激發(fā)光照射光場(chǎng)為整個(gè)芯片區(qū)域，由CCD相機(jī)獲得整個(gè)DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會(huì)使得光場(chǎng)光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號(hào)采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過(guò)傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過(guò)更換物鏡來(lái)調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用[14].
（4）光纖傳感器
有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔�；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶液中的熒光信號(hào)基本不會(huì)傳播到光纖中，雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。
2.．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)
以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類(lèi)繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。
目前應(yīng)用較多的是美國(guó)General Scanning公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專(zhuān)用檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。
七 結(jié)果的分析
樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來(lái)，在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置（Fluidics Station）中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交，這一過(guò)程，僅需要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。這種顯微鏡，將聚焦的平面設(shè)定為芯片的表面，因此可以檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。
為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專(zhuān)用的基因芯片工作站，對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗(yàn)。
八 基因芯片的應(yīng)用
（一）基因表達(dá)分析 基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。與用單探針?lè)治鰉RNA的點(diǎn)雜交技術(shù)不同，基因芯片表達(dá)探針陣列應(yīng)用了大約20對(duì)寡核苷酸探針來(lái)監(jiān)測(cè)每一個(gè)mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。每對(duì)探針中，包含一個(gè)與所要監(jiān)測(cè)的mRNA完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖2），這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對(duì)的探針可以將非特異性雜交和背景訊號(hào)減小到最低的水平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的mRNA。目前，Affymetrix公司已經(jīng)生產(chǎn)出HugeneFL、Mu6500（含有小鼠6 500個(gè)基因）、Ye6100（含有酵母6 100個(gè)基因）等基因芯片成品。
1 分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國(guó)劍橋大學(xué)Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子TFIID和SAGA染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn)[15]。通過(guò)本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。
美國(guó)Stanford大學(xué)的V.R.Iyer等人[16]，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。首先，他們用成纖維細(xì)胞中的8 600個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過(guò)與mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的雜交反應(yīng)，可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中，成纖維細(xì)胞被置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關(guān)閉，兩天后，加入10%的血清，24小時(shí)內(nèi)，分6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測(cè)的基因中，約有500個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中，有28個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖；8個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)；19個(gè)與血管重建有關(guān)；另有許多基因，與血管新生密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過(guò)基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，有助于人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程和特征。
2 基因差異表達(dá)檢測(cè)〔17〕 生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問(wèn)題。理解人類(lèi)基因組中10萬(wàn)個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測(cè)某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)（differential gene expression ，DGE）十分重要。對(duì)差異表達(dá)的研究，可以推斷基因與基因的相互關(guān)系，細(xì)胞分化中基因“開(kāi)啟”或“關(guān)閉”的機(jī)制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前DGE研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）測(cè)序、差減克隆（subtractive cloning ）、差異顯示（differential display）、基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測(cè)大量mRNA的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測(cè)出極其微量的mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測(cè)胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較了6500個(gè)基因，，發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng)RT-PCR進(jìn)行定量后，可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物（Markers）[18]。Sgroi〔19〕報(bào)告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection）用于乳癌浸潤(rùn)期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜（gene expression profiles）差異研究，結(jié)果被定量PCR和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞3萬(wàn)個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別，有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和藥敏。最近，美國(guó)毒物化學(xué)研究所（CIIT） 和國(guó)家環(huán)境健康科學(xué)研究所（NIEHS）正計(jì)劃在一張玻片上建立8 700個(gè)小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我國(guó)也已成功研制出能檢出41 000種基因表達(dá)譜的芯片。美國(guó)Stanford大學(xué)的David Botstein利用cDNA微陣列芯片，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60余萬(wàn)次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類(lèi)學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)�；蛐酒夹g(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
3 發(fā)現(xiàn)新基因 Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個(gè)cDNA片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因，并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測(cè)到胞漿纖維Vimentin的表達(dá)基因，陽(yáng)性率為51%～61%〔20〕。追蹤觀察，有Vimentin表達(dá)的患者，預(yù)后極差。人類(lèi)大量ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中400 000個(gè)ESTs代表了所有人類(lèi)基因，成千上萬(wàn)的ESTs微陣列將為人類(lèi)基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類(lèi)基因組的功能分析〔21〕。
定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和炎癥性腸�。�IBD）的基因表達(dá)研究中，由RA或IBD組織制備探針，用Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記，然后與靶cDNA微陣列雜交，可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF-α、IL或粒細(xì)胞集落刺激因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子。Schena等人[22]報(bào)道了cDNA的微陣列在人類(lèi)基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。采用含1,046個(gè)已知序列的cDNA微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測(cè)不同基因表達(dá)，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，不同表達(dá)模式的陣列成分通過(guò)序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感10倍以上，檢測(cè)限度為1:500,000(wt/wt)總?cè)梭wmRNA。在培養(yǎng)T細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)17個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)，6個(gè)呈現(xiàn)中度抑制，對(duì)相應(yīng)于17個(gè)陣列成分的cDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)5個(gè)表達(dá)最高的成分是5種熱休克蛋白，17個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)3個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測(cè)中[23]，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)陣列成分信號(hào)增強(qiáng)超過(guò)2倍，測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比較揭示有5個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè)是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1，有一個(gè)是未知的。這4個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對(duì)較低，僅呈現(xiàn)2倍的誘導(dǎo)。Northern雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，4種組織中檢測(cè)出15種熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與Jurkat細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因β-actin和細(xì)胞色素C氧化酶在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測(cè)。目前，大量人類(lèi)ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中400,000個(gè)ESTs代表了所有人類(lèi)基因，成千上萬(wàn)的ESTs微陣列將為人類(lèi)基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類(lèi)基因組的功能分析。
4 大規(guī)模DNA測(cè)序 人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（sequencing by hybridization, SBH）技術(shù)及鄰堆雜交（contiguous stacking hybridization, CSH）技術(shù)即是一種新的高效快速測(cè)序方法[24-26]。用含65 536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列，采用SBH技術(shù)，可測(cè)定200 bp長(zhǎng)DNA序列，采用67 108 864個(gè)13聚寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的DNA測(cè)序。計(jì)算機(jī)模擬論證了8聚寡核苷酸微陣列與5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于13聚寡核苷酸微陣列的作用，可測(cè)定數(shù)千個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（fractionation chips）進(jìn)行單鏈DNA分離，再用測(cè)序微陣列（sequencing chips）分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及與鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長(zhǎng)序列的DNA序列測(cè)定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測(cè)序的準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。
正如NIH首腦Harold Varmus在美國(guó)細(xì)胞生物學(xué)1998年年會(huì)上所說(shuō)：“在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測(cè)一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為。”
（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析
在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的，因此分析起來(lái)就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問(wèn)題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。美國(guó)Stanford大學(xué)的E.A.Winzeler等[27]，以?xún)煞N不同菌株的酵母（S96和YJM789）作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)控制酵母對(duì)放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母150 000個(gè)DNA片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有雜交顯色。由于S96對(duì)放線菌酮有抗藥性而YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后，通過(guò)對(duì)S96和YJM789雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定，控制該抗藥性的基因位于15號(hào)染色體，是一長(zhǎng)約57 000個(gè)堿基的片斷。美國(guó)國(guó)家人類(lèi)基因組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協(xié)助下[28]，將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。他們的分析對(duì)象是與人類(lèi)遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的BRCA1基因的外顯子11。在擴(kuò)增后，將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA與BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察時(shí)，用488nm的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測(cè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過(guò)對(duì)15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點(diǎn)存在不同的突變。Hacia等［29］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個(gè)長(zhǎng)度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5 bp)突變。針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)，共有28個(gè)獨(dú)立的探針，14個(gè)針對(duì)有義鏈，14個(gè)針對(duì)反義鏈。14個(gè)探針包括2個(gè)野生型，3個(gè)堿基置換、4個(gè)插入突變、5個(gè)堿基缺失。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變，類(lèi)型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等；在20例對(duì)照樣品中均未檢出假陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果表明DNA芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等［30］分別用兩種DNA芯片檢測(cè)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)的突變，其中一個(gè)芯片包含1 480個(gè)探針，檢測(cè)了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了10個(gè)未知樣品的CFTR基因，其結(jié)果與PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。
Guo等人[31]利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上，采用PCR擴(kuò)增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交，通過(guò)熒光掃描檢測(cè)雜交模式，即可測(cè)定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因等4個(gè)外顯子內(nèi)含有的5個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。β-地中海貧血中變異的檢測(cè)也論證了該方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495個(gè)寡核苷酸探針的微陣列，對(duì)HIV-1基因組反轉(zhuǎn)錄酶基因（rt）及蛋白酶基因（pro）的高度多態(tài)性進(jìn)行了篩選。微陣列中內(nèi)部探針與靶序列的錯(cuò)配具有明顯的不穩(wěn)定性，據(jù)此可快速區(qū)別核酸靶的差異。例如檢測(cè)序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X堿基的種類(lèi)，可用下列4種探針3'AGTCGTAACGGTAGC，3'AGTCGTACCGGTAGC，3'AGTCGTAGCGGTAGC，3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探針陣列可檢則具有特征性的較長(zhǎng)序列相關(guān)的多態(tài)性與變異。篩選1,000個(gè)核苷酸序列的變異與多態(tài)性需要4,000個(gè)探針。用100μm合成位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1.28cm2陣列，將有大約16,000個(gè)探針，能篩選4kb序列。HIV-1基因組中rt與pro在疾病過(guò)程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導(dǎo)致病毒對(duì)多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測(cè)和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來(lái)越重要。Chee等［34］用含有1.35×105個(gè)長(zhǎng)度為25 nt的寡核苷酸探針，分析了16.6 kb的人類(lèi)線粒體基因組DNA(mt DNA)，共分析了10個(gè)樣本，檢測(cè)出了505個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并在Leber′s遺傳性視神經(jīng)疾病患者的mt DNA中檢測(cè)出3個(gè)致病性突變位點(diǎn)。
隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的逐步發(fā)展，研究人員分析出了越來(lái)越多的基因序列。下一步，就是要分析這些基因的多態(tài)性與生物功能和疾病的關(guān)系，而這需要對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行分析。通過(guò)基因芯片SNP（單核苷酸多態(tài)性）定位試驗(yàn)，可以確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系，同時(shí)也可確定致病的機(jī)制和病人對(duì)治療的反應(yīng)等。同樣，對(duì)于許多與人類(lèi)疾病密切相關(guān)的致病微生物，也可對(duì)其進(jìn)行基因型和多態(tài)性分析，1998年，法國(guó)T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技術(shù)，對(duì)人血中的HCV病毒進(jìn)行了基因型分析。SNP基因芯片的成功將使臨床診斷上到一個(gè)新的臺(tái)階。
（三）疾病的診斷與治療 人類(lèi)的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的，就臨床一種新的、強(qiáng)有力的分子工具[36]。基因芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。
1 遺傳病相關(guān)基因的定位 90年代以來(lái),隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的發(fā)展,各種方法被相繼創(chuàng)立并應(yīng)用到基因定位中。我國(guó)有4 000萬(wàn)育齡婦女，每年有2 000萬(wàn)新生兒，準(zhǔn)確檢測(cè)遺傳病基因是優(yōu)生優(yōu)育的技術(shù)保障。DNA芯片充分結(jié)合并靈活運(yùn)用了大規(guī)模集成電路制造技術(shù)、自動(dòng)化技術(shù)、計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標(biāo)記探針、分子雜交及分子生物學(xué)的其它技術(shù),在這一領(lǐng)域的研究中有著巨大的潛力。這一技術(shù)已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來(lái)越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經(jīng)濟(jì)快速又敏感可靠[37,38]。
2 腫瘤診斷 已用基因芯片檢測(cè)人鼻咽癌、肺癌基因表達(dá)譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和定位。早在1996年，M.J.Kozal等就利用基因芯片[39]，對(duì)HIV-I B亞型中的蛋白酶基因的多態(tài)性進(jìn)行了分析，這也是基因芯片技術(shù)被首次應(yīng)用于臨床實(shí)踐。在艾滋病的治療中，使用HIV蛋白酶抑制劑是一種重要的手段。然而，病毒對(duì)該藥物的反應(yīng)卻有著很大的差異。利用基因芯片技術(shù)，研究人員分析了取自102個(gè)病人的167個(gè)病毒單體，發(fā)現(xiàn)這些同為美國(guó)HIV-I B亞種的病毒的基因序列存在極大差異，其中蛋白酶的基因片斷差異最大，在編碼99個(gè)氨基酸的序列中，竟有47.5%存在明顯突變。這些氨基酸的突變，直接導(dǎo)致了病毒抗藥性的不同。含96 600個(gè)20體寡核苷酸高密度陣列對(duì)遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11個(gè)外顯子進(jìn)行雜合變異篩選，15個(gè)患者的已知變異的樣品中，準(zhǔn)確診斷出14個(gè)患者，20個(gè)對(duì)照樣品中未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP調(diào)查42例有乳癌史的家系，p53基因13 964位的G變?yōu)镃，突變率為7.1%；無(wú)乳癌家族史者為0。Favis等用多位PCR/連接酶檢測(cè)反應(yīng)（PCR/LDR）在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)基因突變，用于檢測(cè)大腸癌組織k-ras 和p53突變及BRCA-1和BRCA-2低頻率突變收到良好效果。
人類(lèi)惡性腫瘤中，約有60%與人類(lèi)p53抑癌基因的突變有關(guān)，目前研究人員已經(jīng)研制成功了可以檢測(cè)p53基因所有編碼區(qū)（外顯子2～外顯子11）錯(cuò)意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。以外顯子7的第248個(gè)密碼子為例，野生型為CGG，在芯片上做出5條探針，相應(yīng)位點(diǎn)分別為GAC、GCC、GGC、GTC和G-C，根據(jù)雜交后的熒光顯色圖，就可以分析出該位點(diǎn)為何種突變。
3 感染性疾病的診斷 HIV-1基因組中rt與pro在疾病過(guò)程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導(dǎo)致病毒對(duì)多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測(cè)和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。Hayward[40]以3 648個(gè)插入片段建立獵槍微陣列(shotgun microarray)，通過(guò)差異雜交和DNA測(cè)序找到了瘧原蟲(chóng)無(wú)性和有性生殖階段基因差異表達(dá)，為抗瘧藥設(shè)計(jì)提供了線索�？梢灶A(yù)測(cè)在不久的將來(lái)，人們可望在一張DNA芯片上檢測(cè)幾乎所有的病原微生物基因，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“組合檢測(cè)（profile tests）”。
4 耐藥菌株和藥敏檢測(cè) 據(jù)WHO報(bào)告，全球每年約有800萬(wàn)結(jié)核病患者，有300萬(wàn)人死亡，死亡人數(shù)超過(guò)了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對(duì)不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性（俄國(guó)80%TB對(duì)一種藥物產(chǎn)生抗性；美國(guó)50%為多重耐藥）。對(duì)每例患者進(jìn)行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關(guān)鍵。最近，俄美兩國(guó)科學(xué)家開(kāi)發(fā)了具此功能的基因芯片，可使醫(yī)生及早使用敏感藥物。該芯片（TB Biochips）將抗性菌株的單鏈DNA標(biāo)記后固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見(jiàn)假陽(yáng)性，該芯片可清洗后重復(fù)使用50次。
（四）藥物研究中的應(yīng)用
從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō)，最大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來(lái)開(kāi)發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開(kāi)發(fā)。如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。對(duì)于尋找新藥來(lái)說(shuō)，目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂“譯碼器”策略（Decoder strategy）來(lái)確定藥物靶標(biāo)。從而找到“導(dǎo)向藥物”。基因芯片也被用于尋找蛋白激酶抑制物。細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。
1 新藥開(kāi)發(fā) 高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。噬菌體展示技術(shù)可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫(kù)的建立和篩選，進(jìn)而可用于受體-配體相互作用的研究�；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)（bioinformatics）將大大促進(jìn)制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個(gè)生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。除腫瘤外，用分子生物工程設(shè)計(jì)的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設(shè)計(jì)新的抗生素和工業(yè)用酶等。
同時(shí)，有時(shí)一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能。原先設(shè)想的作用是針對(duì)某一靶標(biāo)的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強(qiáng)的抑制作用，從而開(kāi)發(fā)成另一種新藥。
2 調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況
基因芯片在用來(lái)研究藥物的作用機(jī)理時(shí)十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片構(gòu)建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細(xì)胞后的基因表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)用FK506處理的酵母細(xì)胞基因表達(dá)圖譜與FK506靶標(biāo)的無(wú)意義突變體相似。而用FK506去處理此突變體，發(fā)現(xiàn)了不同于野生型的作用機(jī)制。Clarke等［41］用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達(dá)增加。該研究提示，這類(lèi)研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究, 提供線索。
3 對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)
應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達(dá)，則對(duì)它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規(guī)模的表達(dá)研究往往可省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)。若某個(gè)正在篩選的潛在藥物作用靶細(xì)胞得到的基因表達(dá)圖譜與已知的具有毒性副作用的藥物得到的基因表達(dá)圖譜相似時(shí)，就要考慮是否停止藥物開(kāi)發(fā)（drug development）中花費(fèi)巨大的臨床實(shí)驗(yàn)階段。Nuwaysir等［42］研制了包括涉及細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、氧化應(yīng)激/氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過(guò)氧化物酶體增殖反應(yīng)、二?英/多環(huán)芳烴反應(yīng)、雌激素反應(yīng)、看家基因、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細(xì)胞色素P450等共2 090個(gè)基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 該芯片既可用于毒物的檢測(cè)和遺傳多態(tài)性的檢測(cè)，又可用于受檢毒物的毒作用機(jī)制的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫(kù)中選擇約600個(gè)與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的毒理基因組學(xué)芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點(diǎn)的作用機(jī)制，也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。
（五）基因芯片中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用
中醫(yī)學(xué)中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，還處于初始階段，目前主要集中以下三個(gè)方面：
1中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類(lèi)似。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過(guò)程均被大大簡(jiǎn)化，將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國(guó)際化進(jìn)程，為闡明中藥作用機(jī)理，具有無(wú)可估量的重要意義。
2中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究。中醫(yī)“證”的中醫(yī)藥的臨床治療的核心，但“證”的本質(zhì)研究一直難以有重大進(jìn)展。主要因?yàn)橹嗅t(yī)理論設(shè)及到生命的整體，因而它牽涉到許多基因和蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的方法學(xué)無(wú)法弄清“證”的實(shí)質(zhì)，而利用基因芯片技術(shù)，對(duì)不同“證”狀態(tài)的基因組進(jìn)行掃描，再繪出不同證的基因表達(dá)譜，通過(guò)相關(guān)分析，可望獲得一些有意義的成果。也是從分子基因水平全面揭示“證”本質(zhì)提供了可能。如果證本質(zhì)被揭示，它可能會(huì)引起醫(yī)學(xué)治療學(xué)理論的重大革新或變化，尤其是個(gè)體化治療方案可能重新被重視。
3針灸原理研究。針灸的原理設(shè)及全身各個(gè)部分，針灸不同方法、不同穴位、經(jīng)絡(luò)是否具有不同的作用，也即經(jīng)脈與臟腑間的相關(guān)聯(lián)系是否具有相對(duì)特異性。通過(guò)基因芯片測(cè)量不同組織基因表達(dá)的差異，判斷基因表達(dá)是否具有特異性，有望解決這一長(zhǎng)期爭(zhēng)論不休的問(wèn)題。如果心經(jīng)與心臟具有相對(duì)特異性，那么針刺心經(jīng)后，心臟內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)某些與針刺相關(guān)的特異性基因表達(dá)，而且，這種表達(dá)只在針刺心經(jīng)時(shí)出現(xiàn)，這些基因可能不在其它器官，如肝臟中表達(dá)。那么可以肯定地認(rèn)為經(jīng)脈臟腑相關(guān)是具有相對(duì)特異性的，也可以認(rèn)為傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)理論是有依據(jù)的。
另一方面，基因芯片還有助于揭示針灸的作用機(jī)制。針灸的作用是與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)（NEI networks）密切相關(guān)的，它設(shè)及到細(xì)胞信使、神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等多種因子，但針灸的信號(hào)是如何在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞的過(guò)程仍不明朗，如果引入基因芯片，可以高通量的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的時(shí)空特征，有助于了解針灸促進(jìn)基因表達(dá)的特點(diǎn)，進(jìn)而再利用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)，揭示針灸作用原理�，F(xiàn)在已有部分工作正在進(jìn)行。
（六）其它應(yīng)用
1環(huán)境化學(xué)毒物的篩選 我們的生活環(huán)境中存在著數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)，每種物質(zhì)在投入使用前必須進(jìn)行人體毒性試驗(yàn)，傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)費(fèi)用高昂，且存在著國(guó)際上關(guān)注的動(dòng)物福利（animal welfare）問(wèn)題。采用毒物檢測(cè)芯片（Toxchips）可對(duì)環(huán)境中眾多化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類(lèi)基因的潛在毒性進(jìn)行篩選，探查毒物“開(kāi)啟”或“關(guān)閉”哪些基因，研究“環(huán)境如何改變我們的基因”。NIEHS將對(duì)人類(lèi)100 000個(gè)基因中的12 000個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，弄清致癌物質(zhì)對(duì)基因的改變，建立化學(xué)物質(zhì)指紋庫(kù)（fingerprints of chemicals），然后即可通過(guò)測(cè)定特定基因的突變與否判斷新的合成物質(zhì)的生物毒性。
2體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究。體質(zhì)醫(yī)學(xué)關(guān)系到個(gè)體化治療的核心問(wèn)題，不同的人具有不同的體質(zhì)基礎(chǔ)，其原因與基因型可能存在一定的相關(guān)性，尤其可能與SNP關(guān)系較大，如何全面了解人的SNP差異，以及它與體質(zhì)因素、疾病的易感性間關(guān)系，是值得研究的重大課題。
九 國(guó)內(nèi)外基因芯片生產(chǎn)情況
美國(guó)繼開(kāi)展人類(lèi)基因組計(jì)劃以后，于1998年正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國(guó)防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國(guó)立實(shí)驗(yàn)室如Argonne Oakridge也參與了該項(xiàng)目的研究和開(kāi)發(fā)。英國(guó)劍橋大學(xué)、歐亞公司正在從事該領(lǐng)域的研究。世界大型制藥公司尤其對(duì)基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開(kāi)發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問(wèn)世，而且這些芯片的特點(diǎn)較以前密度更高，檢測(cè)方法更精確，特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。國(guó)內(nèi)目前主要如清華大學(xué)（陳京）、中科院生命科學(xué)院、上海復(fù)旦大學(xué)、北京軍事科學(xué)院、南京東南大學(xué)、西安等四十余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。
主要DNA芯片高科技術(shù)企業(yè)的開(kāi)發(fā)善和各自技術(shù)特點(diǎn)(1998年)[43]
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公司 |
排陣方法 |
結(jié)果讀出 |
主要方向 |
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Affymetrix(Santa Clara,CA) |
單片照相平板印刷法在1.25cm2或5.25cm2薄硅片上合成20～25mer寡核苷酸 |
熒光 |
表達(dá)譜，多態(tài)性分析，診斷 |
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Brax(Cambridge,UK) |
短合成寡核苷酸，離片合成 |
質(zhì)譜儀 |
表達(dá)譜，新基因鑒定，診斷 |
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Hysep(Sunnyvale,CA) |
500～2000nt的DNA樣品打印在0.6cm2(HyGnostics)或～18cm2(Gene Discovery)的膜上 預(yù)制5mer寡核苷酸在玻璃上打印或1.15cm2陣列（HyChip) |
放射性同位素 熒光 |
表達(dá)譜，新基因鑒定，診斷（HyGnostics/ HyChip Array） |
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Incyte Pharmaceuticals(Palo,Alto,CA) |
噴墨式打印PCR片段和在片合成 |
熒光和放射性同位素
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表達(dá)譜，多態(tài)性分析，診斷 |
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Molecular Dynamics(Sunnyvale,CA) |
筆式撈錢(qián)500～5000nt cDNAs于玻璃片上～10cm2` |
熒光 |
表達(dá)譜，新基因鑒定 |
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Nanogen (San Diego,CA) |
電活性點(diǎn)捕捉預(yù)制的～20mer寡核苷酸到≤1cm2硅膜薄片上 |
熒光 |
診斷短片段串聯(lián)重復(fù)序列鑒定 |
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Protogene Laboratories (Palo,Alto,CA) |
通過(guò)打印表面張力陣列在片合成40～50mer寡核苷酸于9cm2玻璃片上 |
熒光 |
表達(dá)譜，多態(tài)性分析 |
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Sequenom(Hamburg,Germany and San Diego,CA) |
背面蹭臟膠印法陣列；20～25mer |
質(zhì)譜儀 |
新基因鑒定，侯選基因確證，診斷，作圖 |
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Synteri(Fremont,CA) |
500～5000nt cDNA打印下于～4cm2玻璃片上 |
熒光 |
表達(dá)譜，新基因鑒定 |
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German Cancer Instiute(Hedelberg,Germany) |
用f-moc或t-moc化學(xué)在片（原型PNA巨片）合成 |
熒光/質(zhì)譜儀 |
表達(dá)譜/診斷 |
十 當(dāng)前面臨的困難
盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，得到人們的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問(wèn)題，例如技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低，重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等問(wèn)題。這些問(wèn)題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個(gè)方面。
1樣品制備上，當(dāng)前多數(shù)公司在標(biāo)記和測(cè)定前都要對(duì)樣品進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增以便提高檢測(cè)的靈敏度，但仍不少人在嘗試?yán)@過(guò)該問(wèn)題，這包括Mosaic Technologies公司的固相PCR擴(kuò)拉體系以及Lynx Therapeutics公司提出大量并行固相克隆方法，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但目前尚未取得實(shí)際應(yīng)用。
2 探針的合成與固定比較復(fù)雜，特別是對(duì)于制作高密度的探針陣列。使用光導(dǎo)聚合技術(shù)每步產(chǎn)率不高（95%），難于保證好的聚合效果。應(yīng)運(yùn)而生的其它很多方法，如壓電打壓、微量噴涂等多項(xiàng)技術(shù)，雖然技術(shù)難度較低方法也比較靈活，但存在的問(wèn)題是難以形成高密度的探針陣列，所以只能在較小規(guī)模上使用。最近我國(guó)學(xué)者已成功地將分子印章技術(shù)應(yīng)用探針的原位合成而且取得了比較滿(mǎn)意的結(jié)果。
3目標(biāo)分子的標(biāo)記也是一個(gè)重要的限速步驟，如何簡(jiǎn)化或繞過(guò)這一步現(xiàn)在仍然是個(gè)問(wèn)題。目標(biāo)分子與探針的雜交會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題：首先，由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用，有必要設(shè)法減少這種不利因素的影響。Southern曾通過(guò)向探針中引入間隔分子而使雜交效率提高于150倍。其次，探針?lè)肿拥?/span>GC含量、長(zhǎng)度以及濃度等都會(huì)對(duì)雜交產(chǎn)生一定的影響，因此需要分別進(jìn)行分析和研究。
4信號(hào)的獲取與分析上，當(dāng)前多數(shù)方法使用熒光法進(jìn)行檢測(cè)和分析，重復(fù)性較好，但靈敏仍然不高。正在發(fā)展的方法有多種，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法等�；蛐酒铣汕先f(wàn)的寡核苷酸探針由于序列本身有一定程度的重疊因而產(chǎn)生了大量的豐余信息。這一方面可以為樣品的檢測(cè)提供大量的難證機(jī)會(huì)，但同時(shí)，要對(duì)如此大量的信息進(jìn)行解讀，目前仍是一個(gè)艱巨的技術(shù)問(wèn)題。
5基因芯片的特異性還有待提高。最近Affymetrix公司生產(chǎn)的基因芯片采用瓣的技術(shù)，已大大提高檢測(cè)的特異性，估計(jì)在今后幾年內(nèi)基因芯片的特異性將大大提高。
6如何檢測(cè)低豐度表達(dá)基因仍是目前一個(gè)重要問(wèn)題�；蛐酒ＷC其特異性、但又要保證能檢測(cè)低豐度表達(dá)的基因，目前尚未解決這一問(wèn)題。因?yàn)樵S多低豐度表達(dá)的基因，也可能表達(dá)出主要執(zhí)行效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。因?yàn)榛虮磉_(dá)與蛋白質(zhì)生成并不成比例。
上述問(wèn)題不僅是當(dāng)前和今后一段時(shí)期內(nèi)國(guó)內(nèi)外基因芯片技術(shù)研究的焦點(diǎn)，同時(shí)也是基因芯片能否從實(shí)驗(yàn)室研究推向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。
十一 基因芯片技術(shù)的研究可能方向
縱觀當(dāng)前基因芯片的研究趨勢(shì)，基因芯片在今后幾年內(nèi)可能的發(fā)展方向，可能有以下幾個(gè)方面：
1．進(jìn)一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達(dá)1.0×105左右，這樣基因數(shù)量在1.0×105以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因表達(dá)情況只用一塊芯片即可包括。
2 提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。如檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光標(biāo)志。多重檢測(cè)以提高特異性，減少假陽(yáng)性。
4高自動(dòng)化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡(jiǎn)單化，成本降低。價(jià)格高昂是目前推廣應(yīng)用的主要障礙之一，但隨著技術(shù)的革新，基因芯片的價(jià)格將會(huì)大大降低。
5高穩(wěn)定性。寡核苷酸探針、RNA均不穩(wěn)定，易受破壞。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探針，可以確保探針的高穩(wěn)定性。
6 研制新的應(yīng)用芯片，如1999年美國(guó)環(huán)保局(EPA)組織專(zhuān)家研討會(huì)，討論了毒理學(xué)芯片的發(fā)展策略。近來(lái)多種新的生物芯片不斷問(wèn)世，這是物理學(xué)、生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)共同的結(jié)晶。
7 研制芯片新檢測(cè)系統(tǒng)和分析軟件，以充分利用生物信息。
8 芯片技術(shù)將與其它技術(shù)結(jié)合使用，如基因芯片PCR、納米芯片等。
9不同生物芯片間綜合應(yīng)用，如蛋白質(zhì)芯片與基因芯片間相互作用等，可用于了解蛋白質(zhì)與基因間相互作用的關(guān)系。
當(dāng)前，基因芯片數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)在增長(zhǎng)，功能也日益完善，但價(jià)格卻大大降低�？梢灶A(yù)見(jiàn)，基因芯片可能在未來(lái)3-5年，也即到2005年左右，將在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，甚至普及使用！到2010年它可能成為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，正如個(gè)人電腦的迅速普及一樣。
基因芯片作為生物芯片的代表，其發(fā)展目標(biāo)同生物芯片的目標(biāo)一樣是“芯片實(shí)驗(yàn)室”(Lab-on-chip)，也即將整個(gè)生化檢測(cè)分析過(guò)程縮微到芯片上。“芯片實(shí)驗(yàn)室”通過(guò)微細(xì)加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門(mén)、微電極等以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)和分析的全過(guò)程，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程趨于自動(dòng)化從而極大地縮短的檢測(cè)和分析時(shí)間，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)材料，而且又降低人為主觀因素，大大提高實(shí)驗(yàn)的客觀性。
總之，基因芯片技術(shù)發(fā)展到今天不過(guò)短短幾年時(shí)間，雖然還存在這樣或那樣的問(wèn)題，但其在基因表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的更加完善基因芯片一定會(huì)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮出其非凡的作用。基因芯片最終的意義和目的不再于本身，而在于它極大地提高了人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的能力和手段，為揭示人類(lèi)這個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。從某種意義上我們可以這樣認(rèn)為：基因的結(jié)構(gòu)或種類(lèi)決定物種；基因的功能或表達(dá)則決定生命，即生物的生、老、病、死�；蛐酒夹g(shù)將為我們提供一條認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的捷徑。當(dāng)然基因芯片并非萬(wàn)能，基因的表達(dá)并非代表生命活動(dòng)本質(zhì)，生命執(zhí)行者應(yīng)是蛋白質(zhì)，因而基因芯片必需同蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)，如二維凝膠電泳、蛋白質(zhì)芯片、大規(guī)模雙雜交體系等相結(jié)合才有望真正揭示生命活動(dòng)的時(shí)空過(guò)程。
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