1、 受體菌的培養(yǎng)

從平板上挑取新的活化后的E.coli TG1單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右，取50ul培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入5ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)1~1．5小時至對數(shù)生長期OD600=0．5左右。

2、 感受態(tài)細(xì)胞的制備

⑴、將培養(yǎng)液1．5ml轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置20分鐘。

⑵、置于4℃，5000rpm離心5分鐘，倒盡上清。

⑶、添加一半菌液體積（750ul）預(yù)冷的50mM的CaCl2，用槍輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，

冰上放置30分鐘。

⑷、4℃,5000rpm離心5分鐘，棄上清。

⑸、再加入200ul預(yù)冷的50mM的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置備用。

新鮮的感受態(tài)細(xì)胞在4~24小時之內(nèi)可直接用于轉(zhuǎn)化，也可加入總體積15%的無菌甘油，

混勻后置于-70℃可保存6個月，轉(zhuǎn)化效率基本不變。

3、轉(zhuǎn)化

⑴、取200ul搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液，加入質(zhì)粒4ul，用槍輕輕吹打均勻，冰浴30分鐘。

⑵、42℃,保溫90秒鐘后，迅速放入冰中，冰浴5min。

⑶、加入37℃預(yù)熱的1ml的LB液體培養(yǎng)基，混勻。37℃培養(yǎng)1小時，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)。

⑷、3000rpm離心10分鐘。

⑸、棄去1ml上清，余下的200ul用槍輕輕吹打均勻，使細(xì)菌充分懸浮后均勻涂布于含Amp的篩選平板上。

⑹、37℃正面向上放置半小時后，倒置培養(yǎng)8~12小時。

對照1、以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與轉(zhuǎn)化組相同。

對照2、以同體積的50mM的CaCl2溶液代替感受態(tài)細(xì)胞懸液，其它操作與轉(zhuǎn)化組相同。