菌落原位雜交(colony in situ hybridization)。是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA,將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交,放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。
實(shí)驗(yàn)步驟如下:
①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上,用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上,排列成方格柵,膜和板上菌落位置相同。
②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。
③在一塊平皿中置4張濾紙,用10%SDS浸透,倒掉多余液體,將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上,菌落面在上,注意防止濾膜底面存有氣泡。
④5min后,將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液(0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸濕的濾紙上,放置10min。
⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液(1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl
pH8.0)浸濕的濾紙上,放置10min,重復(fù)中和一次。
⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上,放置10min,SSPE配成20×貯備液:3.6mol/L NaCl,0.2mol/L
NaH2PO4(pH7.4),20mmol/L EDTANa2(pH7.4)。
⑦將濾膜用濾紙吸干,80℃真空烘干2h。
實(shí)驗(yàn)步驟如下:
①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上,用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上,排列成方格柵,膜和板上菌落位置相同。
②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。
③在一塊平皿中置4張濾紙,用10%SDS浸透,倒掉多余液體,將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上,菌落面在上,注意防止濾膜底面存有氣泡。
④5min后,將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液(0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸濕的濾紙上,放置10min。
⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液(1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl
pH8.0)浸濕的濾紙上,放置10min,重復(fù)中和一次。
⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上,放置10min,SSPE配成20×貯備液:3.6mol/L NaCl,0.2mol/L
NaH2PO4(pH7.4),20mmol/L EDTANa2(pH7.4)。
⑦將濾膜用濾紙吸干,80℃真空烘干2h。