如果兩處理間存在較大差異，以及某些基因在Tester中存在上調(diào)表達（up-regulated expression）時，用RAD方法則達不到預(yù)期目的。于是，Diatchenko. L等于1996年提出了一種可以有效克服基因上調(diào)表達所造成不利后果的克隆基因的新方法——抑制性扣除雜交（SSH）。該方法運用了雜交二級動力學(xué)原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA。從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。而所謂抑制PCR，則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)先于鏈間退火，從而使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。其具體過程第一步與RAD相同，酶切后得到Tester與Driver樣本的平末端cDNA片段。

1.將Tester cDNA均分兩份，分別接上接頭1 (adaptor 1)和接頭2 (adaptor 2)。接頭設(shè)計上，adaptor由一長鏈(40nt)和一短鏈(10nt)組成的一端是平端的雙鏈DNA片段，長鏈3′端與cDNA5′端相連。長鏈外側(cè)序列(約20nt)與第一次PCR引物序列相同，而內(nèi)側(cè)序列則與第二次引物序列同。此外，接頭上含有Ｔ7啟動子序列及內(nèi)切酶識別位點，為以后連接克隆載體和測序提供方便；
2.用過量的Driver樣品分別與兩份Tester樣品進行第一次扣除雜交，分別得到4種產(chǎn)物。這種不充分雜交使得單鏈ｃＤＮＡ分子在濃度上基本相同。同時由于Tester cDNA中與Driver cDNA序列相同片段大都形成異源雙鏈分子ｃ，使得Tester cDNA中差異表達基因得到第一次富集；
3.混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性Driver cDNA進行第二次扣除雜交。此次雜交只有第一次雜交后經(jīng)扣除和豐度均等化的單鏈Tester cDNA能與Driver cDNA形成雙鏈分子。這一次雜交進一步富集了差異表達的cDNA，并且還形成了兩個5′端分別接不同接頭的雙鏈分子ｅ；5′填平末端，加入根據(jù)接頭長鏈序列設(shè)計的內(nèi)、外側(cè)引物進行PCR擴增。第一次PCR是基于其抑制效應(yīng)，只有兩端分別是接頭1和接頭2的具差別表達的序列片段得以指數(shù)擴增。第二次PCR極大提高擴增的特異性，使得差異表達的目的基因片段得到大量富集，并可用于后續(xù)的篩選工作。

SSH自從在克隆基因的實驗中采用以來,其優(yōu)勢是非常明顯的,主要表現(xiàn)在:
1)極大降低了假陽性率,由于SSH方法采用兩次扣除雜交和兩次PCR,保證了該方法具有較高特異性。據(jù)有關(guān)報道證明SSH方法假陽性率可降至6%;
2)具高度靈敏性,由于在反應(yīng)中將豐度不同的單鏈分子含量歸一化,保證了低豐度mRNA檢測成功;
3) SSH法在一次反應(yīng)中,可同時分離出上百個差異表達的基因,這一點遠勝于DDRT-PCR和RAD。
而其缺點與RAD類似。