差別雜交(differential hybridization)又叫差別篩選(differential screening)，適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNA克隆。從本質(zhì)上講，差別雜交也是屬于核酸雜交的范疇。它特別適用于分離在特定組織中表達(dá)的基因、在細(xì)胞周期特定階段表達(dá)的基因、受生長因子調(diào)節(jié)的基因、以及在特定發(fā)育階段表達(dá)的或是參與發(fā)育調(diào)節(jié)的基因，同時(shí)亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的基因。目前，差別雜交篩選法在克隆基因的分離工作中有著相當(dāng)廣泛的用途。
差別雜交的技術(shù)基礎(chǔ)十分簡單，它不需要任何有關(guān)的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍擁有兩種不同的細(xì)胞群體：在一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因正常表達(dá)，在另一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)。在這種情況下便可制備到兩種不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。因此，可以通過這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫進(jìn)行篩選。當(dāng)使用存在目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片井對(duì)照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進(jìn)一步研究使用。
差別雜交篩選技術(shù)已被成功地用于分析爪蟾和粘菌(Dictyostelium)的發(fā)育問題。這兩個(gè)實(shí)際例子表明，處于不同發(fā)育狀態(tài)或階段的豐度相差5倍的特異的mRNA種是能夠被檢測(cè)出來的。生長因子調(diào)節(jié)基因(growth factor—regulatedgene)的克隆，是差別雜交成功應(yīng)用的一個(gè)典型例子。我們知道，血清中含有生長因子，因此用血清處理處于靜止期的細(xì)胞時(shí)，便會(huì)迅速誘發(fā)生長因子調(diào)節(jié)基因進(jìn)行表達(dá)。所以，分別從靜止期細(xì)胞培養(yǎng)物和經(jīng)血清澈活3小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的poly(A)mRNA制劑，在mRNA種類上是有差別的，至少后者比前者多出了一種生長因子調(diào)節(jié)基因的mRNA種。用從激活細(xì)胞中分離的poly(A)mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA與^噬菌體載體重組，構(gòu)成eDNA文庫，并同時(shí)復(fù)制兩份硝酸纖維素濾膜。A組濾膜同血清激活細(xì)胞制備的cDNA探針雜交，B組濾膜同靜止期細(xì)胞制備的cDNA探針雜交。將所得的放射自顯影圖片進(jìn)行仔細(xì)的比較，從中鑒定出只同激活細(xì)胞探針雜交而不能同靜止期細(xì)胞探針雜交的噬菌斑位置。這些克隆便有可能是帶有受血清誘發(fā)表達(dá)的生長因子調(diào)節(jié)基因的DNA編碼序列。

應(yīng)用差別雜交技術(shù)分離克隆的目的基因存在著諸多方面的局限性。首先，差別雜交的靈敏度比較低，特別是對(duì)于那些低豐度的mRNA而言，這個(gè)缺點(diǎn)就顯得更加突出。這是因?yàn)樵诓顒e雜交中所使用的雜交探針是mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA群體。在這些同位素標(biāo)記的探針中，真正能與目的基因核苷酸序列完全互補(bǔ)的僅占很低的比例，以至于那些低豐度的mRNA之cDNA克隆，是很難用此法檢測(cè)出來的。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費(fèi)時(shí)間和金錢的工作。況且兩套平行轉(zhuǎn)移的濾膜之間，DNA的保有量往往是有差別的，這樣所得的雜交信號(hào)的強(qiáng)度也就不會(huì)一致，需要重新進(jìn)行點(diǎn)雜交，以作進(jìn)一步的陽性克隆鑒定工作。所以說重復(fù)性差是差別雜交篩選法的又一個(gè)缺點(diǎn)。
扣除雜交技術(shù)在理論上很具吸引力,但實(shí)際操作并不容易:首先是回收cDNA量有限,并仍存在重復(fù)性差,敏感度低的缺點(diǎn),這些均限制了這一技術(shù)更廣泛的使用。