將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入受體植物，并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的。理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá)，產(chǎn)生人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發(fā)展歷史卻表明，外源基因在受體植物內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無法投入實(shí)際應(yīng)用。另外，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題已在許多國家引起人們的關(guān)注，例如，轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴(kuò)散，抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某些抗生素失去作用等等。以上問題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時(shí)期。針對(duì)這些問題，近幾年人們對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了多方面的探索和改進(jìn)，植物表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化就是其中最重要的一項(xiàng)內(nèi)容，本文就已經(jīng)取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1 啟動(dòng)子的選用和改造
外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題。
目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá)，由于該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過噴酒廉價(jià)、無公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá)，顯然是一個(gè)十分有效的途徑。
在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子，GUS表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合，新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用。
2 增強(qiáng)翻譯效率
為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾，主要考慮三方面內(nèi)容：
2.1添加5‵-3‵-非翻譯序列
許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5‵-3‵-非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游，有一個(gè)由68bp核苷酸組成的Ω元件，這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點(diǎn)，能使Gus基因的翻譯活性提高數(shù)十倍。目前已有許多載體中外源基因的5‵-端添加了Ω翻譯增強(qiáng)序列。Ingelbrecht等曾對(duì)多種基因的 3‵-端序列進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3‵-端序列能使NPTII基因的瞬間表達(dá)提高20倍以上。另外，不同基因的3‵-端序列增進(jìn)基因表達(dá)的效率有所不同，例如，rbcS3‵-端序列對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用比查爾酮合酶基因的3‵-端序列高60倍。
2.2 優(yōu)化起始密碼周邊序列
雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動(dòng)物起始密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較大。Kozak詳細(xì)研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為ACCATGG時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。例如，有一個(gè)細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因，原來的起始密碼周邊序列為UUUAUGG，當(dāng)被修飾為ACCAUGG，其在煙草中的表達(dá)水平提高了8倍。因此，利用非植物來源的基因構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造。
2.3對(duì)基因編碼區(qū)加以改造
如果外源基因是來自于原核生物，由于表達(dá)機(jī)制的差異，這些基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平很低，例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降。美國Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對(duì)殺蟲蛋白基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加了GC含量，去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30～100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。
3 消除位置效應(yīng)
當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有很大差異。這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的。這就是所謂的"位置效應(yīng)"。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會(huì)考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技術(shù)的應(yīng)用。
核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association region,MAR）是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。一般認(rèn)為，MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MAR-gene-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，用于遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達(dá)水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）對(duì)Gus基因在煙草中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍。使用來源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。
另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。
4 構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體
為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來的不安全性等問題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)--葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長點(diǎn)。
由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定，這就為外源基因通過同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)事例載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認(rèn)為這種載體可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化。如果這種載體的通用性得到證實(shí)，那么這項(xiàng)工作無疑為構(gòu)建方便而實(shí)用的新型葉綠體表達(dá)載體提供了一個(gè)好的思路。
由于葉綠體基因組的高拷貝性，定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組的外源基因往往會(huì)得到高效率表達(dá)，例如McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，Bt毒素蛋白的表達(dá)量高達(dá)葉子總蛋白的3%～5%，而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達(dá)到0.001%～0.6%。最近，Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，也發(fā)現(xiàn)毒蛋白在煙草葉子中的表達(dá)量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出20～30倍，轉(zhuǎn)基因煙草不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)生了高抗性的昆蟲。Staub等最近報(bào)道，將人的生長激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，其表達(dá)量竟高達(dá)葉片總蛋白的7%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出300倍。這些實(shí)驗(yàn)充分說明，葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的重要途徑之一。
�。� 定位信號(hào)的應(yīng)用
上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，然而，高水平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問題。
近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列，使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承┩庠吹鞍滋峁┝艘粋�(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前，發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi)，外源蛋白總的積累量比對(duì)照提高了10～20倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前，試圖使基因表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累，從而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源蛋白基因相連接，發(fā)現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號(hào)對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)積累有積極作用，但同一種定位信號(hào)是否適用于所有的蛋白還有待于進(jìn)一步確定。
6 內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用
內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個(gè)內(nèi)含子（intron 1）對(duì)外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強(qiáng)作用。后來，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍。水稻肌動(dòng)蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高2～6倍。至今對(duì)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚，但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tanaka等人的多項(xiàng)研究表明，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。
由于內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)作用，Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體時(shí)，特意將水稻的肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子保留在該基因啟動(dòng)子的下游。同樣，Christensen等在構(gòu)建載體時(shí)將玉米Ubiquitin基因的第一個(gè)內(nèi)含子置于啟動(dòng)子下游，以增強(qiáng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。然而，有研究指出，特定內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用取決于啟動(dòng)子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時(shí)會(huì)取決于內(nèi)含子在載體上的位置。例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于Gus基因的5‵端，在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下，Gus基因的表達(dá)未見增強(qiáng)；當(dāng)把內(nèi)含子置于Gus基因3端，在同樣的啟動(dòng)子控制下，Gus基因的表達(dá)水平卻增加了大約3倍。由此可見，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的作用機(jī)制可能是很復(fù)雜的，如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，目前還缺乏一個(gè)固定的模式，值得進(jìn)一步探討。
7 多基因策略
迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物。但有時(shí)由于單基因表達(dá)強(qiáng)度不夠或作用機(jī)制單一，尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物。如果把兩個(gè)或兩個(gè)以上的能起協(xié)同作用的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，將會(huì)獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用。例如，根據(jù)抗蟲基因的抗蟲譜及作用機(jī)制的不同，可選擇兩個(gè)功能互補(bǔ)的基因進(jìn)行載體構(gòu)建，并通過一定方式將兩個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物中去。王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花，得到了含雙價(jià)抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株。Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草，其抗蟲性和防止害蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提高（專利）。在抗病方面，本實(shí)驗(yàn)室藍(lán)海燕等構(gòu)建了包含β-1，3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入油菜和棉花，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將2～3個(gè)抗真菌病基因和hpt基因連在一個(gè)載體上，兩個(gè)抗蟲基因與bar基因連在另一個(gè)載體上，用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中，結(jié)果表明，70%的R。代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（6～7個(gè)），且導(dǎo)入的多個(gè)外源基因趨向于整合在基因組的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)。
一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化，尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞。而一些功能相關(guān)的基因，比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等，大多成"基因簇"的形式存在。如果將某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色體中自然存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點(diǎn)，那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細(xì)胞一種全新的代謝途徑，產(chǎn)生新的生物分子。不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來的位置效應(yīng)，減少基因沉默等不良現(xiàn)象的發(fā)生。最近，美國的Hamilton和中國的劉耀光分別開發(fā)出了新一代載體系統(tǒng)，即具有克隆大片段DNA和借助于農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接將其轉(zhuǎn)化植物的BIBAC和TAC。這兩種載體不僅可以加速基因的圖位克隆，而且對(duì)于實(shí)現(xiàn)多基因控制的品種改良也會(huì)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于BIBAC和TAC載體在多基因轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用研究還剛剛開始。
8 篩選標(biāo)記基因的利用和刪除
篩選標(biāo)記基因是指在遺傳轉(zhuǎn)化中能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞（或個(gè)體）從眾多的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出來的標(biāo)記基因。它們通�？梢允罐D(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)某種選擇劑具有抗性的產(chǎn)物，從而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在添加這種選擇的培養(yǎng)基上正常生長，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞由于缺乏抗性則表現(xiàn)出對(duì)此選擇劑的敏感性，不能生長、發(fā)育和分化。在構(gòu)建載體時(shí)，篩選標(biāo)記基因連接在目的基因一旁，兩者各有自己的基因調(diào)控序列（如啟動(dòng)子、終止子等）。目前常用的篩選標(biāo)記基因主要有兩大類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可產(chǎn)生對(duì)某種抗生素的抗性，后者可產(chǎn)生對(duì)除草劑的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（產(chǎn)生潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗慶大霉素）等。常用的抗除草劑基因包括EPSP基因（產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（產(chǎn)生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（產(chǎn)生PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。
近幾年來，轉(zhuǎn)基因植物中篩選標(biāo)記基因的生物安全性已引起全球關(guān)注。例如，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物的抗生素抗性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入人或動(dòng)物的病原菌中，從而引起這些病原菌對(duì)抗生素的抗性，使抗生素失去效力。另外，轉(zhuǎn)基因植物通過傳粉將某些基因轉(zhuǎn)移進(jìn)野生近源雜草已有很多報(bào)道，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物的抗除草劑基因轉(zhuǎn)入雜草，會(huì)造成某些雜草難以人為控制。為了避免轉(zhuǎn)基因植物所帶來的不安全因素，近年來在篩選標(biāo)記的使用方面已有了一些新的改進(jìn)。（1）利用生物合成基因作為篩選標(biāo)記基因，提高安全性。例如，某些支鏈氨基酸（賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸）的合成都要經(jīng)過天冬氨酸合成途徑。其中賴氨酸是由天科氨酸激和二羥基吡啶酸合酶催化合成的，兩種酶都受賴氨酸的反饋抑制。細(xì)菌來源的這兩種酶由于對(duì)賴氨酸不敏感，因此可作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，在含賴氨酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因植株能夠存活，而非轉(zhuǎn)基因植株則因死亡而被淘汰。（2）篩選標(biāo)記的去除�？股乜剐曰蚝统輨┛剐曰螂m然有利于轉(zhuǎn)化體的篩選，但它們對(duì)植物的生長并非必要。如果能剔除轉(zhuǎn)基因植株的篩選標(biāo)記基因，將是提高安全性的最好方法。例如，Dale等利用Cre/lox重組系統(tǒng)，先將一種篩選標(biāo)記插入lox位點(diǎn)，再與目的基因相連，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。在第二輪轉(zhuǎn)化時(shí)，將另一種篩選標(biāo)記與Cre序列連接后再轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在Cre重組酶的作用下，第一種篩選標(biāo)記可被刪除。挑取已失去第一篩選標(biāo)記的植株，待開花結(jié)籽后，從后代分離群體中挑選沒有第二種篩選標(biāo)記的植株，即為已完全剔除了篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。除了Cre/lox重組系統(tǒng)以外，利用FLP/FRT重組系統(tǒng)也可將篩選標(biāo)記基因去除。另外，將篩選標(biāo)記基因和目的基因分別構(gòu)建在不同的載體上，通過共轉(zhuǎn)化，然后從后代的分離群體中挑選，也可獲得無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。（3）篩選標(biāo)記基因的失活。為了減少抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物帶來的不安全性，還有些研究者采用反義RNA基因，核酸裂解酶（ribozymes）基因或采用抗體基因等策略使篩選標(biāo)記基因或基因拉物失活。但這些方法的缺點(diǎn)是沒有去除篩選標(biāo)記基因，仍存在基因傳播的可能性。
植物基因工程經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展歷程，雖然取得了令世人矚目的成績，但仍有許多問題一直困擾著這個(gè)領(lǐng)域的研究者。突出的問題表現(xiàn)在外源基因往往表達(dá)效率不高，難以得到理想的轉(zhuǎn)基因植物（作物），轉(zhuǎn)基因作物的安全性不好。這些問題不僅成為植物基因工程發(fā)展的限制因素，而且也是近幾年在西歐等國家對(duì)轉(zhuǎn)基因作物有較大爭(zhēng)議甚至產(chǎn)生排斥反應(yīng)的直接原因之一。本文簡要介紹了國內(nèi)外在構(gòu)建植物表達(dá)載體方面的一些新進(jìn)展，這些策略的最終目的都是為了更好地增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，提高生物工程體的安全性。希望它能為該領(lǐng)域的研究人員引發(fā)一些思考，促進(jìn)我國植物基因工程的進(jìn)一步發(fā)展。
1 啟動(dòng)子的選用和改造
外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題。
目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá)，由于該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過噴酒廉價(jià)、無公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá)，顯然是一個(gè)十分有效的途徑。
在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子，GUS表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合，新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用。
2 增強(qiáng)翻譯效率
為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾，主要考慮三方面內(nèi)容：
2.1添加5‵-3‵-非翻譯序列
許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5‵-3‵-非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游，有一個(gè)由68bp核苷酸組成的Ω元件，這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點(diǎn)，能使Gus基因的翻譯活性提高數(shù)十倍。目前已有許多載體中外源基因的5‵-端添加了Ω翻譯增強(qiáng)序列。Ingelbrecht等曾對(duì)多種基因的 3‵-端序列進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3‵-端序列能使NPTII基因的瞬間表達(dá)提高20倍以上。另外，不同基因的3‵-端序列增進(jìn)基因表達(dá)的效率有所不同，例如，rbcS3‵-端序列對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用比查爾酮合酶基因的3‵-端序列高60倍。
2.2 優(yōu)化起始密碼周邊序列
雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動(dòng)物起始密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較大。Kozak詳細(xì)研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為ACCATGG時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。例如，有一個(gè)細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因，原來的起始密碼周邊序列為UUUAUGG，當(dāng)被修飾為ACCAUGG，其在煙草中的表達(dá)水平提高了8倍。因此，利用非植物來源的基因構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造。
2.3對(duì)基因編碼區(qū)加以改造
如果外源基因是來自于原核生物，由于表達(dá)機(jī)制的差異，這些基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平很低，例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降。美國Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對(duì)殺蟲蛋白基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加了GC含量，去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30～100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。
3 消除位置效應(yīng)
當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有很大差異。這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的。這就是所謂的"位置效應(yīng)"。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會(huì)考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技術(shù)的應(yīng)用。
核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association region,MAR）是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。一般認(rèn)為，MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MAR-gene-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，用于遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達(dá)水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）對(duì)Gus基因在煙草中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍。使用來源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。
另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。
4 構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體
為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來的不安全性等問題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)--葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長點(diǎn)。
由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定，這就為外源基因通過同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)事例載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認(rèn)為這種載體可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化。如果這種載體的通用性得到證實(shí)，那么這項(xiàng)工作無疑為構(gòu)建方便而實(shí)用的新型葉綠體表達(dá)載體提供了一個(gè)好的思路。
由于葉綠體基因組的高拷貝性，定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組的外源基因往往會(huì)得到高效率表達(dá)，例如McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，Bt毒素蛋白的表達(dá)量高達(dá)葉子總蛋白的3%～5%，而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達(dá)到0.001%～0.6%。最近，Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，也發(fā)現(xiàn)毒蛋白在煙草葉子中的表達(dá)量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出20～30倍，轉(zhuǎn)基因煙草不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)生了高抗性的昆蟲。Staub等最近報(bào)道，將人的生長激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，其表達(dá)量竟高達(dá)葉片總蛋白的7%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出300倍。這些實(shí)驗(yàn)充分說明，葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的重要途徑之一。
�。� 定位信號(hào)的應(yīng)用
上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，然而，高水平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問題。
近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列，使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承┩庠吹鞍滋峁┝艘粋�(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前，發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi)，外源蛋白總的積累量比對(duì)照提高了10～20倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前，試圖使基因表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累，從而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源蛋白基因相連接，發(fā)現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號(hào)對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)積累有積極作用，但同一種定位信號(hào)是否適用于所有的蛋白還有待于進(jìn)一步確定。
6 內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用
內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個(gè)內(nèi)含子（intron 1）對(duì)外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強(qiáng)作用。后來，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍。水稻肌動(dòng)蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高2～6倍。至今對(duì)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚，但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tanaka等人的多項(xiàng)研究表明，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。
由于內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)作用，Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體時(shí)，特意將水稻的肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子保留在該基因啟動(dòng)子的下游。同樣，Christensen等在構(gòu)建載體時(shí)將玉米Ubiquitin基因的第一個(gè)內(nèi)含子置于啟動(dòng)子下游，以增強(qiáng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。然而，有研究指出，特定內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用取決于啟動(dòng)子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時(shí)會(huì)取決于內(nèi)含子在載體上的位置。例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于Gus基因的5‵端，在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下，Gus基因的表達(dá)未見增強(qiáng)；當(dāng)把內(nèi)含子置于Gus基因3端，在同樣的啟動(dòng)子控制下，Gus基因的表達(dá)水平卻增加了大約3倍。由此可見，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的作用機(jī)制可能是很復(fù)雜的，如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，目前還缺乏一個(gè)固定的模式，值得進(jìn)一步探討。
7 多基因策略
迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物。但有時(shí)由于單基因表達(dá)強(qiáng)度不夠或作用機(jī)制單一，尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物。如果把兩個(gè)或兩個(gè)以上的能起協(xié)同作用的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，將會(huì)獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用。例如，根據(jù)抗蟲基因的抗蟲譜及作用機(jī)制的不同，可選擇兩個(gè)功能互補(bǔ)的基因進(jìn)行載體構(gòu)建，并通過一定方式將兩個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物中去。王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花，得到了含雙價(jià)抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株。Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草，其抗蟲性和防止害蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提高（專利）。在抗病方面，本實(shí)驗(yàn)室藍(lán)海燕等構(gòu)建了包含β-1，3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入油菜和棉花，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將2～3個(gè)抗真菌病基因和hpt基因連在一個(gè)載體上，兩個(gè)抗蟲基因與bar基因連在另一個(gè)載體上，用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中，結(jié)果表明，70%的R。代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（6～7個(gè)），且導(dǎo)入的多個(gè)外源基因趨向于整合在基因組的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)。
一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化，尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞。而一些功能相關(guān)的基因，比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等，大多成"基因簇"的形式存在。如果將某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色體中自然存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點(diǎn)，那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細(xì)胞一種全新的代謝途徑，產(chǎn)生新的生物分子。不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來的位置效應(yīng)，減少基因沉默等不良現(xiàn)象的發(fā)生。最近，美國的Hamilton和中國的劉耀光分別開發(fā)出了新一代載體系統(tǒng)，即具有克隆大片段DNA和借助于農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接將其轉(zhuǎn)化植物的BIBAC和TAC。這兩種載體不僅可以加速基因的圖位克隆，而且對(duì)于實(shí)現(xiàn)多基因控制的品種改良也會(huì)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于BIBAC和TAC載體在多基因轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用研究還剛剛開始。
8 篩選標(biāo)記基因的利用和刪除
篩選標(biāo)記基因是指在遺傳轉(zhuǎn)化中能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞（或個(gè)體）從眾多的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出來的標(biāo)記基因。它們通�？梢允罐D(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)某種選擇劑具有抗性的產(chǎn)物，從而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在添加這種選擇的培養(yǎng)基上正常生長，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞由于缺乏抗性則表現(xiàn)出對(duì)此選擇劑的敏感性，不能生長、發(fā)育和分化。在構(gòu)建載體時(shí)，篩選標(biāo)記基因連接在目的基因一旁，兩者各有自己的基因調(diào)控序列（如啟動(dòng)子、終止子等）。目前常用的篩選標(biāo)記基因主要有兩大類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可產(chǎn)生對(duì)某種抗生素的抗性，后者可產(chǎn)生對(duì)除草劑的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（產(chǎn)生潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗慶大霉素）等。常用的抗除草劑基因包括EPSP基因（產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（產(chǎn)生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（產(chǎn)生PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。
近幾年來，轉(zhuǎn)基因植物中篩選標(biāo)記基因的生物安全性已引起全球關(guān)注。例如，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物的抗生素抗性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入人或動(dòng)物的病原菌中，從而引起這些病原菌對(duì)抗生素的抗性，使抗生素失去效力。另外，轉(zhuǎn)基因植物通過傳粉將某些基因轉(zhuǎn)移進(jìn)野生近源雜草已有很多報(bào)道，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物的抗除草劑基因轉(zhuǎn)入雜草，會(huì)造成某些雜草難以人為控制。為了避免轉(zhuǎn)基因植物所帶來的不安全因素，近年來在篩選標(biāo)記的使用方面已有了一些新的改進(jìn)。（1）利用生物合成基因作為篩選標(biāo)記基因，提高安全性。例如，某些支鏈氨基酸（賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸）的合成都要經(jīng)過天冬氨酸合成途徑。其中賴氨酸是由天科氨酸激和二羥基吡啶酸合酶催化合成的，兩種酶都受賴氨酸的反饋抑制。細(xì)菌來源的這兩種酶由于對(duì)賴氨酸不敏感，因此可作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，在含賴氨酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因植株能夠存活，而非轉(zhuǎn)基因植株則因死亡而被淘汰。（2）篩選標(biāo)記的去除�？股乜剐曰蚝统輨┛剐曰螂m然有利于轉(zhuǎn)化體的篩選，但它們對(duì)植物的生長并非必要。如果能剔除轉(zhuǎn)基因植株的篩選標(biāo)記基因，將是提高安全性的最好方法。例如，Dale等利用Cre/lox重組系統(tǒng)，先將一種篩選標(biāo)記插入lox位點(diǎn)，再與目的基因相連，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。在第二輪轉(zhuǎn)化時(shí)，將另一種篩選標(biāo)記與Cre序列連接后再轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在Cre重組酶的作用下，第一種篩選標(biāo)記可被刪除。挑取已失去第一篩選標(biāo)記的植株，待開花結(jié)籽后，從后代分離群體中挑選沒有第二種篩選標(biāo)記的植株，即為已完全剔除了篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。除了Cre/lox重組系統(tǒng)以外，利用FLP/FRT重組系統(tǒng)也可將篩選標(biāo)記基因去除。另外，將篩選標(biāo)記基因和目的基因分別構(gòu)建在不同的載體上，通過共轉(zhuǎn)化，然后從后代的分離群體中挑選，也可獲得無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。（3）篩選標(biāo)記基因的失活。為了減少抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物帶來的不安全性，還有些研究者采用反義RNA基因，核酸裂解酶（ribozymes）基因或采用抗體基因等策略使篩選標(biāo)記基因或基因拉物失活。但這些方法的缺點(diǎn)是沒有去除篩選標(biāo)記基因，仍存在基因傳播的可能性。
植物基因工程經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展歷程，雖然取得了令世人矚目的成績，但仍有許多問題一直困擾著這個(gè)領(lǐng)域的研究者。突出的問題表現(xiàn)在外源基因往往表達(dá)效率不高，難以得到理想的轉(zhuǎn)基因植物（作物），轉(zhuǎn)基因作物的安全性不好。這些問題不僅成為植物基因工程發(fā)展的限制因素，而且也是近幾年在西歐等國家對(duì)轉(zhuǎn)基因作物有較大爭(zhēng)議甚至產(chǎn)生排斥反應(yīng)的直接原因之一。本文簡要介紹了國內(nèi)外在構(gòu)建植物表達(dá)載體方面的一些新進(jìn)展，這些策略的最終目的都是為了更好地增強(qiáng)外源基因的表達(dá)水平，提高生物工程體的安全性。希望它能為該領(lǐng)域的研究人員引發(fā)一些思考，促進(jìn)我國植物基因工程的進(jìn)一步發(fā)展。
