①重復(fù)性.影響SSCP重復(fù)性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個(gè)條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復(fù)性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時(shí)有的DNA片段 可能只呈現(xiàn)一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的 立體構(gòu)象.有時(shí)三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的 結(jié)果.
�、诎蠨NA序列長(zhǎng)度的影響在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SSCP對(duì)短鏈DNA或RNA的點(diǎn)突變檢出率要比長(zhǎng)鏈 的高，這可能是由于長(zhǎng)鏈DNA和RNA分子中單個(gè)堿基的改變?cè)诰S持立體構(gòu)象中起的作用 較小的緣故.而有人認(rèn)為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長(zhǎng)度不會(huì)影響SSCP 的效果.他們仔細(xì)選擇了實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)354bp的DNA中點(diǎn)突變的檢出率仍可達(dá)到90%以 上.
�、垭娪倦妷汉蜏囟鹊挠绊�:為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP應(yīng)在較低溫 度下進(jìn)行(一般4℃-15℃之間).在電泳過(guò)程中除環(huán)境溫度外，電壓過(guò)高也是引起溫度 升高的主要原因，因此，在沒(méi)有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開(kāi)始的5min應(yīng)用較 高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開(kāi)始的高電壓可以使 不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定電泳電壓.
�、蹹NA片段中點(diǎn)突變的位置對(duì)SSCP的影響點(diǎn)突變?cè)贒NA和RNA中的位置對(duì)SSCP檢測(cè)率的 影響，取決于該位置對(duì)維持立體構(gòu)象作用的大小，而不是僅僅取決于點(diǎn)突變?cè)贒NA鏈 上的位置(有人認(rèn)為點(diǎn)突變?cè)贒NA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測(cè)出來(lái)).White曾 設(shè)計(jì)了一組樣品DNA片段，并將其中的點(diǎn)突變?cè)O(shè)在DNA鏈的中部，而且該點(diǎn)又正處在發(fā) 夾結(jié)構(gòu)頂端的環(huán)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSCP只能檢測(cè)出9個(gè)樣品中的2個(gè)(檢出率為22%)，說(shuō)明 DNA鏈中任何部位的突變，只要對(duì)其單鏈立體構(gòu)象沒(méi)有影響，都有可能被漏檢.
�、軸SCP的結(jié)果斷定:由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據(jù)單鏈DNA分子和帶電量 的大小來(lái)分離的，而是以單鏈DNA片段空間構(gòu)象的立體位阻大小來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的，因 此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長(zhǎng)度在16--18cm以上，以檢測(cè)限為指標(biāo)來(lái)判 定結(jié)果.檢測(cè)限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大于檢 測(cè)限則判定鏈的遷移率有改變，說(shuō)明該DNA序列有變化，小于檢測(cè)限則說(shuō)明鏈之間無(wú) 變化.例如，一般檢測(cè)限定為3mm，那么當(dāng)兩帶間距離在3mm以上，則說(shuō)明兩鏈之間有 改變.另外檢測(cè)限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽(yáng)性結(jié)果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產(chǎn)物的上樣量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具 體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定.總之，SSCP分析法是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的突變檢測(cè)方法， 適合臨床實(shí)驗(yàn)室的要求.它可以檢測(cè)各種點(diǎn)突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著 SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個(gè)有力工具.
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�、垭娪倦妷汉蜏囟鹊挠绊�:為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP應(yīng)在較低溫 度下進(jìn)行(一般4℃-15℃之間).在電泳過(guò)程中除環(huán)境溫度外，電壓過(guò)高也是引起溫度 升高的主要原因，因此，在沒(méi)有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開(kāi)始的5min應(yīng)用較 高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開(kāi)始的高電壓可以使 不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定電泳電壓.
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�、軸SCP的結(jié)果斷定:由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據(jù)單鏈DNA分子和帶電量 的大小來(lái)分離的，而是以單鏈DNA片段空間構(gòu)象的立體位阻大小來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的，因 此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長(zhǎng)度在16--18cm以上，以檢測(cè)限為指標(biāo)來(lái)判 定結(jié)果.檢測(cè)限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大于檢 測(cè)限則判定鏈的遷移率有改變，說(shuō)明該DNA序列有變化，小于檢測(cè)限則說(shuō)明鏈之間無(wú) 變化.例如，一般檢測(cè)限定為3mm，那么當(dāng)兩帶間距離在3mm以上，則說(shuō)明兩鏈之間有 改變.另外檢測(cè)限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽(yáng)性結(jié)果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產(chǎn)物的上樣量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具 體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定.總之，SSCP分析法是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的突變檢測(cè)方法， 適合臨床實(shí)驗(yàn)室的要求.它可以檢測(cè)各種點(diǎn)突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著 SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個(gè)有力工具.
