聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù),是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴增的技術(shù),可檢出微量靶序列(甚至少到1個拷貝)。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板,在一對引物介導(dǎo)下,在數(shù)小時 內(nèi)可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應(yīng)分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個的模板,這樣經(jīng)過九小時的循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板,這樣經(jīng)過數(shù)上時的循環(huán)后,可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共進(jìn)行30次循環(huán)左右,最后再延伸72℃5分鐘,4℃冷卻終止反應(yīng)。
1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的方法。
2.競爭逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。
3.多重PCR(multiples PCR)在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長,發(fā)生多處缺失的???
4.多種PCR可同時加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。
5.反向PCR(iverse polymerase chain reaction)對一個已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴增和研究。
6.不對稱PCR在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度,以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測定,以了解目的基因的序列。
7.錨定PCR(anchored polymerase chain reaction)幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序,將互補的引物連接于一段帶限制性內(nèi)切酶位點的錨上,在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下,將未知序列擴增出來。
8.著色互補試驗或熒光PCR(color complementation assay or fluorescent PCR)原理是用不同熒光染粒,分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上,同時擴增多個DNA片段,反應(yīng)完畢后,利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴增產(chǎn)物,就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶缺失,則會缺乏相應(yīng)的顏色。
9.雙溫PCR(two-temperature PCR)僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃?梢蕴岣叻磻(yīng)的速度和特異性。
上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用:(1)PCR技術(shù)擴增特定序列為基礎(chǔ),采用多種方法進(jìn)行檢測,如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針;(2)通過選擇性擴增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針;(2)通過選擇性擴增cDNA中的特殊片段,產(chǎn)生針對尚未克隆的基因的探針;(3)從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫;(4)產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA;(5)分析 基因突變;(6)做染色體步移。
10.原位PCR技術(shù):PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA,但擴增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位,因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系,這是該技術(shù)一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力,但由于其敏感性問題,尤其是在石蠟切片中,尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR(In situ PCR,簡稱IS PCR),它可使擴增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位,從而彌補了PCR和原位雜交的不足,具有良好的應(yīng)用前景。目前,已有多種設(shè)計的原位PCR擴增儀系統(tǒng)問世,使操作簡便,軟件靈活,已成為拉增固定細(xì)胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。
IS PCR的技術(shù)特點
(1)既具有PCR的特異性與高靈敏性,又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性;(2)測到低于2個拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列,甚至可檢測出單一細(xì)胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA;(3)有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析;(4)可用于正;驉盒约(xì)胞,感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。
IS PCR的基本方法
IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事,實質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進(jìn)行原位雜交的技術(shù),操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過程,首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液,然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴增,最后通過標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交檢測擴增產(chǎn)物。
初步應(yīng)用
有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查,通過PCR擴增,僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒。從開始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查,已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法(間接法),也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物,讓標(biāo)記物擴增后再行ISH檢查的直接法。因此,目前就原位PCR方法而言,尚未能獲得統(tǒng)一,也即未能比較出哪一種方法最可靠簡便,各家報道的原位PCR技術(shù)中,在標(biāo)本處理和種類上尚不同(細(xì)胞懸液、涂片、組織切片等),想檢測的靶核酸也不同(病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA),擴增的方法上有不同(單引物、多引物),最后顯示的方法也不同(直接法、間接法)。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗,以求一致。
原位PCR應(yīng)用的課題,目前正片于開始階段,還很局限,對人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測定,歸納起來,主要應(yīng)用于兩方面;(1)檢測外源懷基因片段,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。