雜交信號的檢測是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。

由于所使用的標(biāo)記物不同，因而相應(yīng)的探測方法也各具特色。大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo)記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測DNA化學(xué)發(fā)光。通過檢測標(biāo)記信號來確定DNA芯片雜交譜型。
1．熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法
使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。
（1）激光掃描熒光顯微鏡
探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計算機(jī)控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計算機(jī)控制傳動平臺X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。
(2)激光掃描共焦顯微鏡
激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時進(jìn)行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設(shè)計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開來是一個非常重要的問題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時，避開樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結(jié)果的影響。激光器前也放置一個小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個探針上。通過計算機(jī)控制激光束或樣品池的移動，便可實(shí)現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用�，F(xiàn)在 Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12萬美元。
（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡
這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測，因而激發(fā)光照射光場為整個芯片區(qū)域，由CCD相機(jī)獲得整個DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會使得光場光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過更換物鏡來調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用[14].
（4）光纖傳感器
有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔�；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。

2.．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測
以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。

目前應(yīng)用較多的是美國General Scanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集，由計算機(jī)處理熒光信號，并對每個點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。