一般說(shuō)來(lái)應(yīng)用DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過(guò)程：生物學(xué)問(wèn)題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測(cè)；數(shù)據(jù)處理和建模。
1．樣品制備。一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3μg mRNA計(jì)算的
不同組織抽提3－10μg mRNA所需組織量
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器官/組織* |
提取3μgmRNA所需組織量(克) |
提取10μgmRNA所需織量(克) |
總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織] |
mRNA所占百分比[%] |
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成人正常組織 |
肝 |
0.2083 |
0.6944 |
1.80 - 1.80 mg/g |
0.80 |
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成人正常組織 |
腦 |
缺數(shù)據(jù) |
缺數(shù)據(jù) |
1.30 - 1.30 mg/g |
缺數(shù)據(jù) |
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成人正常組織 |
肺 |
0.3000 |
1.0000 |
1.00 - 1.00 mg/g |
1.00 |
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成人正常組織 |
心 |
0.5000 |
1.6667 |
0.60 - 0.60 mg/g |
1.00 |
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成人正常組織 |
胃 |
0.1852 |
0.6173 |
2.70 - 2.70 mg/g |
0.60 |
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成人正常組織 |
喉 |
0.3125 |
1.0417 |
1.20 - 1.20 mg/g |
0.80 |
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病理組織 |
結(jié)腸癌 |
0.2521 |
0.8403 |
1.70 - 1.70 mg/g |
0.70 |
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病理組織 |
胃癌 |
0.4317 |
1.4388 |
0.50 - 0.50 mg/g |
1.39 |
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病理組織 |
空腸腺癌 |
0.3571 |
1.1905 |
1.40 - 1.40 mg/g |
0.60 |
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病理組織 |
直腸癌 |
0.1604 |
0.5348 |
1.70 - 1.70 mg/g |
1.10 |
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病理組織 |
肝癌 |
0.1116 |
0.3720 |
3.84 - 3.84 mg/g |
0.70 |
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病理組織 |
肺癌 |
0.1282 |
0.4274 |
2.00 - 2.00 mg/g |
1.17 |
考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過(guò)程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。
2 樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)．
組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程,(取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理要求 )
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鋁箔 |
經(jīng)DEPC水浸泡過(guò)夜，78°C烘干，高壓滅菌后烘干 |
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1.5 ml 微離心管 |
市場(chǎng)有售RNAase-Free的相應(yīng)規(guī)格離心管 |
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標(biāo)簽紙 |
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記號(hào)筆 |
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樣品登記表 |
由客戶指定專人填寫(xiě) |
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液氮罐 |
應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來(lái)源 |
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取材部位的病理切片 |
由客戶提供1-2張 |
注：
· 以下步驟1 － 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。
· 對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。
1 離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門(mén)部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）。
2在RNase-Free 0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。
3 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫(xiě)明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。
4 填寫(xiě)樣品登記表，寫(xiě)明樣品名稱、種類(lèi)、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等
將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐
5 保留1-2張取材部位的病理切片。
