雜交反應(yīng)的條件類似于傳統(tǒng)的Southern或Northern雜交。具體的選擇視研究目的而定，例如，進(jìn)行多態(tài)性分析或雜交測(cè)序時(shí)，要求能夠區(qū)分單個(gè)堿基的變異，所以需要較高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性；而用于表達(dá)譜檢測(cè)的芯片為了提高檢測(cè)的特異性、保證較高的靈敏度，需要較長(zhǎng)的雜交時(shí)間，高的嚴(yán)謹(jǐn)性、高的樣品濃度、較低的雜交溫度等。同時(shí)，雜交反應(yīng)還必需考慮反應(yīng)液中的鹽濃度、探針序列的G C含量、探針?biāo)鶐щ姾汕闆r、探針與芯片片基間連接臂的長(zhǎng)度及種類，靶序列二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素。固定于芯片表面的探針或蛋白、多肽分子與位于液相的靶分子進(jìn)行生化反應(yīng)（作用）的過(guò)程不完全與液相中生化反應(yīng)相同。其原因在于，生物大分子與固相支持物的結(jié)合導(dǎo)致了溶液中的靶分子與其不能迅速地發(fā)生作用，延長(zhǎng)了反應(yīng)時(shí)間，必要時(shí)還必需提高靶分子的濃度以加快反應(yīng)。而且，固相化的大分子，特別是空間體積較小的分子，很容易受到支持物對(duì)生化反應(yīng)的空間阻礙作用。如何解決以上問(wèn)題是生物芯片技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵之一。 有研究表明，在探針?lè)肿优c片基間加入適當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可使雜交效率提高上百倍。連接臂將固相化的探針?lè)肿优c支持物隔開一定的距離，減少空間阻礙作用。另外，不帶電荷的肽核酸(PNA)也可與DNA形成PNA-DNA雜交體，且比DNA-DNA或DNA-RNA雜交體更為穩(wěn)定的，防止核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)雜交反應(yīng)的影響，所以適合進(jìn)行單個(gè)堿基錯(cuò)配的分析。PNA還能夠抵御蛋白酶與核酸酶的降解，具有很高的穩(wěn)定性[4]。目前由于PNA合成難度較大、成本高尚未得到大量的應(yīng)用。為加快雜交反應(yīng)速度，美國(guó)Nanogen公司研制的電子芯片通過(guò)在雜交位點(diǎn)引如電場(chǎng)而使雜交和沖洗過(guò)程速度大大增加。它在1mm2的位點(diǎn)上制作有微電極陣列，其上覆以鏈親和素標(biāo)記的瓊脂糖[5,6]。生物素標(biāo)記的探針?lè)肿涌煽焖俚亟Y(jié)合到位于電極上方的瓊脂糖上，從而提高了雜交速度。其原理為:當(dāng)位于待檢位點(diǎn)鏈親和素標(biāo)記的瓊脂糖凝膠下方的微電極引入直流正電壓后，溶液中的生物素標(biāo)記化的探針就可在電場(chǎng)的作用下快速泳動(dòng)并濃縮結(jié)合于該處。同樣的道理，可以使待檢的DNA分子快速濃縮于此，從而有力地雜交反應(yīng)迅速進(jìn)行。雜交完成后，改變電場(chǎng)方向、可將未雜交的樣品DNA從檢測(cè)位點(diǎn)“洗”去，選擇適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)強(qiáng)度就可以使非特異雜交的DNA與未雜交的探針選擇性地從特定位點(diǎn)分開除去，而保留完全雜交的DNA分子。由于電場(chǎng)的這種濃縮和選擇特性，使得該方法有很高的靈敏度和特異性，最重要的是它使原來(lái)數(shù)小時(shí)的雜交反應(yīng)縮短到二三十秒鐘。Gene Logic公司研制的生物芯片將探針?lè)肿庸潭ㄅc微通道內(nèi)，標(biāo)記后的核酸樣品流過(guò)時(shí)便會(huì)濃縮富集于通道內(nèi)，同樣也可縮短雜交過(guò)程，提高檢測(cè)的靈敏度，降低試劑消耗。