世界上第一次將精子與卵子共置于玻璃試管或試皿內(nèi)進(jìn)行受精試驗(yàn),而非在體內(nèi)時,即被稱之為體外受精。
初生母牛的卵巢中,約含有十至三十萬個卵母細(xì)胞,隨著成長過程,卵巢逐漸增大,重量亦隨之增加。卵母細(xì)胞的來源可以經(jīng)由屠宰場取得的卵巢,采集卵巢上未成熟的卵母細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)使其成熟,或應(yīng)用超音波掃描以觀察濾泡發(fā)育狀態(tài),自活體吸取卵母細(xì)胞。
胚的體外生產(chǎn)系統(tǒng)包含:卵的體外成熟、體外受精及胚的體外培養(yǎng)等三大部分。早期研究體外受精技術(shù)甚為困難,一九九○年時,美國及加拿大經(jīng)由體外受精生產(chǎn)的小牛,總數(shù)不超過一百頭。
活體取卵是近十年來新發(fā)展的技術(shù),經(jīng)過不斷地改善,已經(jīng)有商業(yè)化的儀器與設(shè)備供應(yīng)。這些設(shè)備需要超音波儀,并配備固定功率的探頭,以及真空幫浦和采卵針。從超音波儀看到小濾泡時,立即將采卵針刺進(jìn)小濾泡,負(fù)壓作用即將濾泡液和卵母細(xì)胞吸入離心管內(nèi)。母牛每周以采集兩次所得的卵母細(xì)胞品質(zhì)較好,數(shù)量也較多。平均每次約可收集到10個卵母細(xì)胞。
當(dāng)牛只發(fā)育成長,排卵前卵子重新進(jìn)行減數(shù)分裂,使核增大。濾泡成熟的過程,需經(jīng)過初級、次級、三級的發(fā)育階段,最后始成為成熟濾泡,當(dāng)卵子由成熟的濾泡排出時稱為排卵。
在濾泡成熟的后期,卵母細(xì)胞也逐漸成熟,細(xì)胞核亦進(jìn)行減數(shù)分裂,達(dá)到第一次減數(shù)分裂中期的階段,稱為初級卵母細(xì)胞。初級卵母細(xì)胞再經(jīng)一次減數(shù)分裂,即分裂為次級卵母細(xì)胞以及一個稱為第一極體的較小細(xì)胞,此時達(dá)到第二次減數(shù)分裂中期。細(xì)胞分裂的過程中,當(dāng)有第一極體排出時,即顯示核已達(dá)到成熟,可以準(zhǔn)備受精,這是重要的標(biāo)記,利用立體顯微鏡即可觀察到。發(fā)育成熟的次級卵母細(xì)胞,經(jīng)排卵并被精子受精后,再繼續(xù)完成其減數(shù)分裂,直到排出第二極管后才會進(jìn)行一般細(xì)胞的有絲分裂,發(fā)育成為早期胚。
從屠宰場取得的卵母細(xì)胞,必須經(jīng)過體外成熟階段才能進(jìn)行受精。體外成熟的培養(yǎng)液一般采用組織培養(yǎng)液如TCM199,另外再添加胎牛血清,它有促進(jìn)卵子體外成熟及確保較佳的卵裂效果。
精子與卵發(fā)生受精作用之前必先經(jīng)過獲能,這是一個非常復(fù)雜的精子生理變化過程。在體內(nèi)受精情形下,精子必須先在雌性生殖道中,經(jīng)過數(shù)小時的獲能準(zhǔn)備才有受精的能力;在這段期間中,精子發(fā)生的生理生化改變,包括去除精子表面附著的抗原物質(zhì),以及進(jìn)行頭帽反應(yīng),尤其是在頭帽內(nèi)至少要有四種酵素的激活和釋放。精子欲穿過卵子的透明帶,必須要靠這些酵素來溶解卵丘細(xì)胞團(tuán)及透明帶。
體外精子獲能的方法,主要是靠添加肝素或是咖啡因來處理。凡能促使鈣離子進(jìn)入頭帽的刺激,均可誘發(fā)獲能。
體外受精即是將已經(jīng)完成獲能的精子和成熟的卵母細(xì)胞,共同置于受精用溶液中,然后將之靜置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
受精完成并卵裂為二至四細(xì)胞的受精卵稱為胚。經(jīng)體外受精后的早期胚,在繼續(xù)卵裂發(fā)育的過程中,會發(fā)生發(fā)育阻滯現(xiàn)象。不同的動物出現(xiàn)細(xì)胞發(fā)育阻滯的時期不同,牛羊?yàn)榘酥潦?xì)胞期,豬為四細(xì)胞期,小鼠為二細(xì)胞期。因此如何克服牛的細(xì)胞發(fā)育阻滯現(xiàn)象,確保其發(fā)育能越過十六細(xì)胞期,是早期研究的重點(diǎn)。最早是利用兔子的輸卵管,將受精完成并卵裂的牛胚,移入已結(jié)扎的兔子輸卵管中,移植后第五天,再從兔子的輸卵管回收已發(fā)育至桑椹期或囊胚期的胚,再進(jìn)行胚移置到受胚牛。
目前用來克服早期胚在體外發(fā)生發(fā)育阻滯的方法,是采用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。將胚與卵丘細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞或子宮上皮細(xì)胞等體細(xì)胞共同培養(yǎng),即可克服發(fā)育阻滯現(xiàn)象,使胚能繼續(xù)發(fā)育,直到成為桑椹期或囊胚期,再做移置。
當(dāng)母牛的生理周期與胚發(fā)育階段不一致時,移入的胚不能順利發(fā)育,而導(dǎo)致懷孕失敗,因此必須利用內(nèi)泌素對牛只進(jìn)行處理,來調(diào)整母牛的發(fā)情周期使之同期化。其目的在使母牛于預(yù)定的時間集中發(fā)情,以便實(shí)施有計(jì)畫的胚移置工作,提高受胎率。
同期發(fā)情處理應(yīng)用的內(nèi)分泌素有多種選擇,最常用的是前列腺素;其功能是當(dāng)卵巢有黃體存在時,經(jīng)注射前列腺素后即被消解,于是在二至三天內(nèi)又能誘發(fā)一個新的發(fā)情周期,因此能掌控排卵時間及胚移置的最佳進(jìn)行時機(jī)。
當(dāng)新鮮胚移置時,供胚牛與受胚牛的卵巢和子宮生理狀態(tài)亦必須一致,才有利于未來胚的持續(xù)發(fā)育及著床。胚在發(fā)育早期和子宮組織間尚未建立密切的關(guān)系,此一階段的發(fā)育,基本上是依靠本身儲存的養(yǎng)分,所以沖洗子宮后取得的胚,較易存活,一旦放回與供胚牛相似的受胚牛的子宮環(huán)境中,移置的胚即能繼續(xù)發(fā)育。
供胚牛與受胚牛的發(fā)情同期化程度,差異不得超過六小時,否則會降低受胎率;也就是說,供胚牛在發(fā)情、配種后七至八天取胚,受胚牛也應(yīng)在相同時間接受移置。
在大型哺乳動物采用非手術(shù)法移置技術(shù),此技術(shù)從一九七六年以后即廣泛應(yīng)用于牛。牛胚移置的器材與人工授精相似,僅有口徑較小與長度較長的差異而已。移置前,將胚放入胚管并且裝入移置器;移置時,自生殖道插入移置器直到子宮頸外口,另一手則深入直腸找到子宮頸,緩緩配合將移置器送入子宮角內(nèi),并在預(yù)定的位置將胚注入。