隨著DNA合成技術(shù)的發(fā)展，特別是自動化合成技術(shù)的引入，人們能簡便、快速、高效地合成其感興趣的DNA片段。目前，DNA合成技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段，并且已在基因工程、臨床診斷和治療、法醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域中日益發(fā)揮重要的作用。
1. DNA合成在基因工程和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用
1.1合成基因
目前有許多基因和蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列已得到闡明，人們已經(jīng)可以根據(jù)需要合成出具有實際應(yīng)用和研究價值的多肽和蛋白質(zhì)基因。已報道的合成基因有人生長激素、干擾素、胰島素、表皮生長因子、白細(xì)胞介素II、集落刺激因子等，這些基因均已被克隆，絕大多數(shù)已在原核和真核系統(tǒng)中獲得表達。我國上海生物化學(xué)研究所等單位于19841年首次在世界上合成了具有生物學(xué)活性的酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸，為人類文明作出了應(yīng)用的貢獻。
目前，合成基因的方式有2種。①全基因合成：一般對于分子較小而又不易得到的基因采用該方式�？蓪㈦p鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基在在100個核苷酸以上時)，每個片段長度控制在40～60個堿基，并使每對相鄰互補的片段之間有～6個堿基交叉重疊。在體外將除基因兩端末端外的所有片段磷酸化�；旌贤嘶鸷蠹尤隓NA連接酶，即可得到較大的基因片段。如果需連接亞克隆的方法，最后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。采用分步連接、亞克隆的方法時，為便于亞克隆中回收基因片段。應(yīng)在片段兩側(cè)設(shè)計合適的酶切位點，由于每個亞克隆可以分別鑒定，從而可減少順序錯誤的可能性。②酶促合成：此法又稱基因的半合成。全基因，特別是較大的基因的全部化學(xué)合成成本昂貴，使用半合成的方法可以降低成本，從而利于普及使用。首先合成末端之間有10～14個互補堿基的寡核苷酸片段，退火后以重疊區(qū)作為引物，在4種dNTP存在的條件下，通過DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反轉(zhuǎn)錄酶的作用，獲得兩條完整的互補雙鏈。在合成基因的結(jié)構(gòu)中，應(yīng)包括有克隆和表達所需要的全部信號及DNA順序，基因密碼的閱讀框架也應(yīng)該同表達體系相適應(yīng)。此外，由于不同種類的生物體或密碼子的使用都具有明顯的選擇性，在基因合成和克隆時必須考慮這個問題。選擇合適的密碼子，以獲得高效表達。
1.2 合成探針
基因的克隆和分離已成為現(xiàn)代分子生物這研究必不可少的手段。DNA合成技術(shù)在其中起著越來越重要的作用。它不僅使得過去頗費周折的基因篩選與鑒定成為常規(guī)技術(shù)，而且使得克隆載體的構(gòu)建及克隆基因和載體的連接變得更加容易和準(zhǔn)確。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以通過mRNA的結(jié)構(gòu)間接地得出。相反，如果已知某個肽段的氨基酸順序，也可根據(jù)密碼簡并的原則推導(dǎo)出所有可能的mRNA序列密碼。人工合成的具有特定順序的寡聚DNA片段，已應(yīng)用于篩選和鑒定重組質(zhì)�；颚耸删w。實驗證明用合成的寡核苷酸片段，即使只有1對堿基錯配采用嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交也能與完全互補的雙鏈相區(qū)別。因此，使用作探針的寡核苷酸，應(yīng)將密碼的簡并度調(diào)至最高限度時，可減少假陽性，增加篩選的準(zhǔn)確率。
1.3 合成引物
1.合成PCR引物進行基因擴增：PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。該法操作簡便，可在短時間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)的特異性取決于所用引物和模板DNA結(jié)合的特異性。合成引物在PCR反應(yīng)中的使用。
2.序列測定用引物：DNA序列測定是分子生物學(xué)中最重要和最精細(xì)的研究技術(shù)，其中最常使用的是末端終止法，即是一種依賴于特異DNA引物的序列測定方法，此外該法對模板的需要量較大，這就要求待測DNA片段尤其是拷貝數(shù)少的片段首先克隆到適合的載體中經(jīng)過擴增后進行序列測定。常用的克隆載體如M13、pUC19、PBR322等均可購到有商品出售的公用測序引物。
3.合成導(dǎo)入突變用的引物：利用寡核苷酸引導(dǎo)的突變，可在目的DNA序列的任何部分產(chǎn)生點突變、插入和缺失，從而使得基因編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生改變。
1.4 合成連接子和接頭
在DNA重組中常需要將外源DNA片段插入某些載體DNA中。如果載體或外源DNA上沒有合適的限制性內(nèi)切酶位點，為提高插入效率或?qū)崿F(xiàn)定向克隆，可采用合成連接子(linker)和接頭(adaptor)的方法。使用連接子和接頭需要插入片段是平末端，否則，首先需要用DNA聚合酶I大片段補齊或者用核酸酶S1或Bal31處理得到平末端后才可同連接子或接頭連接。
具有多酶切點的接頭(polylinker)還廣泛應(yīng)用于構(gòu)建某些運載體，使之帶有多個新的酶切位點。這在質(zhì)粒pUC系列及用于序列分析的M13mp噬菌體系統(tǒng)中都得到了廣泛的應(yīng)用。接頭片段帶用來調(diào)整表達載體的讀碼框架，用于基因表達及功能的研究。
２ 合成基因在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對疾病的認(rèn)識已逐步從整體和器官的水平深入到細(xì)胞分子水平。醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)，許多嚴(yán)重危害人類健康的疾病，如遺傳性疾病、腫瘤、心血管疾病等可在基因結(jié)構(gòu)上找到某些變化，如基因的缺失、突變、轉(zhuǎn)位或致病左因的存在，以此作為證據(jù)亦可對這些疾病作同相應(yīng)的判斷。例如鐮刀狀細(xì)胞貧血癥即是由于A→T突變造成β-珠蛋白第六位谷氨酸變?yōu)槔i氨酸，從而造成珠蛋白結(jié)構(gòu)異常，并引起紅細(xì)胞形態(tài)及對氧的親合力發(fā)生改變。通過人工合成的19個核苷酸作為探針即可明確區(qū)別正常人、雜合和純合的病人。目前，合成DNA探針已廣應(yīng)用于臨床，成為一種有效的診斷手段。
２.1 用于遺傳病的診斷
過去僅有少數(shù)遺傳性疾病可以憑借蛋白質(zhì)和酶學(xué)方面的異常作出判斷，隨著分子生物這的發(fā)展，對遺傳病的診斷有了巨大的進步，出現(xiàn)了基因診斷法。醫(yī)學(xué)上使用基因診斷法最早成功的報道是1985年Saiki等人對鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的診斷。另外，對于以突變?yōu)橹鞯摩?地中海貧血，以合成DNA片段為探針，亦可得同滿意的結(jié)果。
２.2 用于傳染病的診斷
臨床上對傳染性疾病的傳統(tǒng)診斷程序常常是檢濁病原體及其抗體，需時較長，達不到早期診斷的目的。合成探針在傳染病特別是由病毒感染性所致的傳染病檢測中，已得到廣泛應(yīng)用，尤其是結(jié)合PCR方法使診斷的靈敏度可進一步提高，目前國內(nèi)已制出檢測乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、輪狀病毒和皰疹疾病等多種基因探針診斷試劑盒。
人工合成核酸在醫(yī)學(xué)上不僅可以作為一種手段，而且在某些疾病的治療上顯露了端倪寡聚核苷酸及其衍生物對腫瘤的治療已經(jīng)取得可喜的進展。作為蛋白質(zhì)翻譯抑制劑的寡核苷酸現(xiàn)稱為反義RNA或反義DNA。其作用原理可能有以下幾種：①反義RNA與體內(nèi)靶mRNA結(jié)合形成雙螺旋，使mRNA不能成為翻譯蛋白質(zhì)的模板。②反義RNA(DNA)與DNA結(jié)合。影響DNA復(fù)制。③反義RNA能阻止mRNA與核蛋白體結(jié)合，降低蛋白質(zhì)合成效率。
反義RNA或反義DNA最近年來國際上研究課題的熱點，人們寄希望它在抗病毒，尤其是對艾滋病和腫瘤基因治療上發(fā)揮重要，為征服這兩類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病作出貢獻。