在某些情況（例如用寡核苷酸作Southern印跡雜交的探針）下，重要的是要將寡核苷酸標記至盡可能高的放射性比活度。磷酸化反應最多能使每一寡核苷酸分子中摻入一個32P原子。但用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成與合成寡核苷酸互補的DNA鏈， 則可得到比活度更高探針（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物與寡核苷酸模板結合，后者的序列互補于所用的放射性標記探針。 該引物后在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，從而使[γ－³²P]dNTP在模板指導下發(fā)生摻入。反應后，通過對模板和產(chǎn)物進行變性繼而通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳交將它們分開。用這種方法，有可能生成這樣一種寡核苷酸探針，即每一寡核苷酸分子帶有若干個放射性原子。其放射性比活度可高達2x10¹⁰計數(shù)/（分．mg）。對該法進行改進后，可以由兩段3'端含互補序列的寡核苷酸合成更長的探針（Ullrich等，1984a）。
在準備進行這些類型的反應時，務必考慮以下幾點：

（1）反應中[α-32P]dNTP的比活度 α－磷酸已完全被³² P置換的一個dNTP分子的比活度大約為9000Ci/mmol。比活度更低的制品所含的是³² P標記的和未標記的分子混合物。這樣，假如用比活度為3000Ci/mmol的單種d NTP參與合成反應，同時該種核苷酸在混合物中的可摻入位置又只有3個，那么每個探針分子應將平均只帶上一個³²P 原了（即其比活度將約等于用T4噬菌體多核苷酸激酶標記的探針）。如果知道目標探針的序列和得前體的比活度，應有可能預計當1種、2種、3種和全部4種dNTP摻入反就時所得的探針的比活度。

（2）反應中dNTP的濃度 反慶中每種d NTP的濃度應不低于1μmol/L，否則核苷酸的聚合就無法有效地進行。所以。至關重要的是要確保在反應進行的過程中底物濃度不降至1μmol/L（約0.66ng/μl）以下， 應根據(jù)板應中所有的單鏈序列全部作用模板這一假設來計算可摻入探針的每種dNTP的總量。 反應中每種dNTP的總量應為可摻入探針的量加上0.66ng/μl所得的和。

（3）引物的長度和特異性 引物必須有足夠的長度的特異性，以便能與模板結合并在適當位置上啟動合成。用于本用途的引物通長7－9個核苷酸，并與模板寡核苷酸3'端或緊鄰3'端的序列互補。由于難以預測中短雜交體的穩(wěn)定性，故應有著手大規(guī)模反應之前，通過實驗確定引物與模板間的比例應為多少才能使探針的產(chǎn)量最大。

（4）終產(chǎn)物的長度 終產(chǎn)物是與模板等長或比模板稍短（這主要取決于與引物互補的序列在模板上的位置）的雙錠DNA片段，為了盡可能得到最有效的探針，必須將非標記模板鏈從放射性標記的互補產(chǎn)物中有效地分離出去，否則兩長互補鏈將互相退火，從而遏制與所需要的靶序列的雜交。對于短于30 個核苷酸， 進行19％聚丙稀酰胺凝膠電泳是分離互補鏈的最為有效的方法。如果兩長鏈長度再稍有不同。則分離效率不可以更高，所以，應當說可能將引物設計成與模板上毗今最末端的核苷酸互補。假如引物與模板3'端2－3個核苷酸不能雜交， 那么放射性標記引物應會比非標記的模板短一些，通過電泳進行分離的效率也就更高。不過，即使模板與產(chǎn)物的長度相同，兩者在電泳過程中仍然極的可能得到一定程度的分離。因為單鏈核酸在凝膠中的遷移率不僅取決于鏈長，而且也取地堿基組成和序列。在合成探會之前用無放射性的ATP將兩針鏈之一（模板或引物）磷酸化 ， 或者通過保留連在引物5' 端的二甲氧三苯甲基（Studencki和Wallace，1984），通常還可以提高分離程度。 由于我們不呆能預料究竟何種方法對于某一特定的寡核苷酸最為有效，因此通常有必要進行一系列預實驗，以確定在各種情況下產(chǎn)物與模板分離的效率。

1）在微量離心管中將[α－³²P]ATP混勻， 依據(jù)能使比活度達到要求和足以在所有模板鏈上進行全長合成的需要來計算[α－³²P]ATP的量。切記dNTP深度在反應的任何階段都不得于1μmol/L。為保證諸試劑的濃度足夠高，應以盡可能小的體積進行反應。 所以最好使用保存于醇－水溶液中供應的放射性標記dNTP作底物， 而不用以水性緩沖液為供應者。適當體積的[α－³²P] ATP的乙醇溶液既可在作反應用的離心管中進行混合。，又能在管中蒸發(fā)至干。

2）向離心管內(nèi)加入適量的引物和模板DNA。為保證引物能夠有效地引導反應，其摩爾數(shù)應過量，達到模板的3-10倍。

3）加0.1體積的10xKlenow緩沖液。充分混勻。
10xKlenow緩沖液
0.4mol/L磷酸鉀（pH7.5）
66mmol/L MgCl2
10mmol/L β－巰基乙醇

4）按每5反應體積2－4單位加入大腸桿菌DNA聚合酶IKoenow片段。充分混勻。

5）用等體積的凝膠加樣緩沖液將反應稀釋，并于80℃加熱3分鐘，隨后將全部的反應液加樣至變性聚丙烯酰胺凝膠（即加7mol尿灌制者）。
凝膠加樣緩沖液
80％（W/V） 甲酰胺
590mmol/L Tris-硼酸（pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％(W/V)溴酚藍
甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理；并用Whatman1號濾紙過濾2次。去離子甲酰胺分裝成小體積，充氮存于－70℃。按照反應混合液中寡核苷酸大小的不同，用于制膠的聚丙烯酰胺的濃度和電泳條件也不相同。下表列出一些在常用的提示

聚丙烯酰胺凝膠通常用1xTBE（89mmolk/L Tris-硼酸、2mmol/L EDTA）灌制，電泳亦在相同緩沖液中進行。
6）電泳結束后，卸下電泳裝置，將其中一面玻璃板與凝膠分開。小心：未摻入的[α－32P]ATP可能已遷移至下槽緩沖液中而使之具有放射性！ 將凝膠及其背面的玻璃板裹于Saran包裝膜內(nèi)。記下示蹤染料的位置，用手提式小型探測器在凝膠上應含有寡核苷酸的部位檢測放射性活度值。將一組涂有放射性墨水的粘性圓點標簽紙圍繞品的同邊粘貼在Saran包裝膜上，用Scotch膠帶將圓點標簽紙覆蓋，以防放射性墨水法染X光片夾或增感屏。交凝膠對放射自顯影底片進行曝光，摻入探針的放射性相當高，數(shù)分鐘仙即可在膠片上得到影像。利用上述方法中圓點標簽上的放射性標記定出凝膠中探針的位置。切下條帶，方法回收放射性標記寡核苷酸。放射性墨水系上少量32P與防水的黑色繪圖墨水混合而成。為方便起見，我們將這種墨水分為3級：極熱級（>2000計數(shù)/秒，據(jù)手提式小型探器）、熱級（500-2000計數(shù)/秒，據(jù)手提式小型探測器）和冷級（50-500計數(shù)/秒， 據(jù)手提式小型探測器）。用一纖維尖筆將所要求等級的墨水涂在粘性標簽紙上。應在該纖維尖筆上貼上放射性物質(zhì)的專用提示膠帶，妥善保管。