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樣品預(yù)處理的目的是為了除去干擾物、增加檢測(cè)器靈敏度(富集) 、保護(hù)色譜柱等，同時(shí)也是為了防止儀器罷工。其中樣品萃取是勝敗的關(guān)鍵一步,要從大量的干擾物中萃取出微量組分難度極大。樣品預(yù)處理應(yīng)包括進(jìn)樣前的一切操作。除了稱重、溶解、稀釋等步驟外，還需要走這幾步:
①過濾;
②萃取;
③衍生化(柱前衍生) ;
④液相色譜(低壓柱層析)。
可以是手工進(jìn)行也可以實(shí)行自動(dòng)化操作。
樣品預(yù)處理的方法:
有些樣品經(jīng)預(yù)處理后還不能作進(jìn)樣分析,需進(jìn)行衍生化處理，使一些無(wú)紫外吸收或無(wú)熒光的組分,經(jīng)過衍生化后能用紫外和熒光檢測(cè)器檢測(cè)，這樣既提高了靈敏度，又改善了分離度(質(zhì)量變化) 。
用于液相色譜分析的樣品溶液要求很高，必須均勻無(wú)顆粒,有顆粒會(huì)損壞進(jìn)樣器并阻塞柱頭。處理好的樣品在準(zhǔn)備上柱前應(yīng)對(duì)準(zhǔn)光線搖動(dòng)，檢查樣品溶液中有無(wú)顆粒。只要看到顆粒、混濁或乳化，就應(yīng)過濾一下，過濾膜要能截留住0.15μm 以上的顆粒。
萃取的目的是從共溶的樣品介質(zhì)中分離出被分析的組分，或者減少損壞柱的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)和干擾物。一般采用有機(jī)溶劑萃取，要求萃取用的溶劑毒性低、揮發(fā)性好、雜質(zhì)少、對(duì)待測(cè)樣品有良好的溶解度且與水又不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者兩種以上的混合溶劑。萃取后一般可直接進(jìn)樣，有時(shí)需要濃縮或吹干濃縮,再用定體積的液體或流動(dòng)相溶解進(jìn)樣，這樣增加了樣品濃度、提高了靈敏度，同時(shí)避免了溶劑峰對(duì)樣品峰的干擾。在萃取時(shí)要考慮樣品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性組分外，還有用脂溶性的組分制成水溶性的鹽。
1、水溶性樣品
(1) 酸性組分及生成的鹽萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成酸性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┙夂筮M(jìn)樣。
(2) 堿性組分及生成的鹽萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成堿性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
(3) 中性組分萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后,直接用反相色譜法分析。
2、脂溶性組分萃取方法:
有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣，或在N2流下吹干，用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
分析中可能出現(xiàn)的污染
一般檢測(cè)的環(huán)境、容器、試劑都是影響測(cè)定結(jié)果的因素。
1、環(huán)境污染
儀器室的有害氣體、氣溶液、灰塵等等都能造成污染，影響檢測(cè)結(jié)果,這種污染很難校正。因此,儀器室與其他實(shí)驗(yàn)室應(yīng)隔離，保持清潔,儀器室內(nèi)應(yīng)安裝空調(diào),注意防潮、防腐、防震、空氣相對(duì)濕度應(yīng)小于70%為宜。
2、容器
實(shí)驗(yàn)室常用的器皿有玻璃類、瓷類、石英類、塑料類等，在進(jìn)行分析時(shí),應(yīng)按照待則樣品的要求來選則器皿,不管使用哪種器皿,容器的洗條清潔都是很重要的，也是取得好的檢測(cè)結(jié)果的基本保證。
3、試劑
在液相色譜分析中,所選用的試劑必須是色譜純、優(yōu)級(jí)純或分析純,如果用含量有雜質(zhì)的試劑,則會(huì)出現(xiàn)雜峰而影響測(cè)定結(jié)果。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的要求
在配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，先要配置現(xiàn)定濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中最好使用同一批次配制的內(nèi)標(biāo)溶液以減少誤差。
(1) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是色譜純的、性質(zhì)穩(wěn)定。
(2) 常用的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)存放在棕色溶液瓶中低溫保存。
(3) 在配制維生素類標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。
樣品預(yù)處理過程中可能出現(xiàn)的問題
(1)色譜圖中出現(xiàn)無(wú)關(guān)的峰,原因有可能是樣品過濾器帶來污染,解決方法如下:
①將過濾器浸泡在樣品溶劑中并進(jìn)樣試驗(yàn);
②改變過濾器類型;
③采用交替清洗技術(shù)。
(2) 一些或全部化合物的峰比預(yù)期的小,尤其是低濃度的樣品,原因可能是樣品過濾器表面吸附下降,解決方法如下:
①改變過濾器類型;
②嚴(yán)格按相同條件處理所用樣品;
③采用交替清洗技術(shù)。
(3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解決方法如下:
①增加萃取時(shí)間,使用熱溶劑;
②修改清洗方法。
(4) 色譜峰變寬,柱壽命縮短,原因可能是樣品帶來的干擾與污染,應(yīng)改進(jìn)清洗方法。
(5) 精度差,原因可能是回收不完全,解決方法如下:
①改進(jìn)或替換衍生化、分離、萃取或其他條件;
②用自動(dòng)化處理裝置提高精度。
樣品預(yù)處理的方法:
有些樣品經(jīng)預(yù)處理后還不能作進(jìn)樣分析,需進(jìn)行衍生化處理，使一些無(wú)紫外吸收或無(wú)熒光的組分,經(jīng)過衍生化后能用紫外和熒光檢測(cè)器檢測(cè)，這樣既提高了靈敏度，又改善了分離度(質(zhì)量變化) 。
用于液相色譜分析的樣品溶液要求很高，必須均勻無(wú)顆粒,有顆粒會(huì)損壞進(jìn)樣器并阻塞柱頭。處理好的樣品在準(zhǔn)備上柱前應(yīng)對(duì)準(zhǔn)光線搖動(dòng)，檢查樣品溶液中有無(wú)顆粒。只要看到顆粒、混濁或乳化，就應(yīng)過濾一下，過濾膜要能截留住0.15μm 以上的顆粒。
萃取的目的是從共溶的樣品介質(zhì)中分離出被分析的組分，或者減少損壞柱的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)和干擾物。一般采用有機(jī)溶劑萃取，要求萃取用的溶劑毒性低、揮發(fā)性好、雜質(zhì)少、對(duì)待測(cè)樣品有良好的溶解度且與水又不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者兩種以上的混合溶劑。萃取后一般可直接進(jìn)樣，有時(shí)需要濃縮或吹干濃縮,再用定體積的液體或流動(dòng)相溶解進(jìn)樣，這樣增加了樣品濃度、提高了靈敏度，同時(shí)避免了溶劑峰對(duì)樣品峰的干擾。在萃取時(shí)要考慮樣品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性組分外，還有用脂溶性的組分制成水溶性的鹽。
1、水溶性樣品
(1) 酸性組分及生成的鹽萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成酸性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┙夂筮M(jìn)樣。
(2) 堿性組分及生成的鹽萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后調(diào)成堿性,再加有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣,或在N2 流下吹干,用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
(3) 中性組分萃取方法：有機(jī)溶劑萃取雜質(zhì)后,直接用反相色譜法分析。
2、脂溶性組分萃取方法:
有機(jī)溶劑萃取或進(jìn)樣，或在N2流下吹干，用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)樣。
分析中可能出現(xiàn)的污染
一般檢測(cè)的環(huán)境、容器、試劑都是影響測(cè)定結(jié)果的因素。
1、環(huán)境污染
儀器室的有害氣體、氣溶液、灰塵等等都能造成污染，影響檢測(cè)結(jié)果,這種污染很難校正。因此,儀器室與其他實(shí)驗(yàn)室應(yīng)隔離，保持清潔,儀器室內(nèi)應(yīng)安裝空調(diào),注意防潮、防腐、防震、空氣相對(duì)濕度應(yīng)小于70%為宜。
2、容器
實(shí)驗(yàn)室常用的器皿有玻璃類、瓷類、石英類、塑料類等，在進(jìn)行分析時(shí),應(yīng)按照待則樣品的要求來選則器皿,不管使用哪種器皿,容器的洗條清潔都是很重要的，也是取得好的檢測(cè)結(jié)果的基本保證。
3、試劑
在液相色譜分析中,所選用的試劑必須是色譜純、優(yōu)級(jí)純或分析純,如果用含量有雜質(zhì)的試劑,則會(huì)出現(xiàn)雜峰而影響測(cè)定結(jié)果。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的要求
在配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，先要配置現(xiàn)定濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中最好使用同一批次配制的內(nèi)標(biāo)溶液以減少誤差。
(1) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是色譜純的、性質(zhì)穩(wěn)定。
(2) 常用的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)存放在棕色溶液瓶中低溫保存。
(3) 在配制維生素類標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。
樣品預(yù)處理過程中可能出現(xiàn)的問題
(1)色譜圖中出現(xiàn)無(wú)關(guān)的峰,原因有可能是樣品過濾器帶來污染,解決方法如下:
①將過濾器浸泡在樣品溶劑中并進(jìn)樣試驗(yàn);
②改變過濾器類型;
③采用交替清洗技術(shù)。
(2) 一些或全部化合物的峰比預(yù)期的小,尤其是低濃度的樣品,原因可能是樣品過濾器表面吸附下降,解決方法如下:
①改變過濾器類型;
②嚴(yán)格按相同條件處理所用樣品;
③采用交替清洗技術(shù)。
(3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解決方法如下:
①增加萃取時(shí)間,使用熱溶劑;
②修改清洗方法。
(4) 色譜峰變寬,柱壽命縮短,原因可能是樣品帶來的干擾與污染,應(yīng)改進(jìn)清洗方法。
(5) 精度差,原因可能是回收不完全,解決方法如下:
①改進(jìn)或替換衍生化、分離、萃取或其他條件;
②用自動(dòng)化處理裝置提高精度。
特殊樣品的移液技巧
多數(shù)情況下，移液器的移液對(duì)象是水溶液，但也難免會(huì)碰到一些特殊的樣品，如高揮發(fā)性樣品、高粘度樣品、高密度樣品等。如果需要經(jīng)常轉(zhuǎn)移這些特殊的樣品，建議購(gòu)買外置活塞原理的移液器，雖然耗材成本有點(diǎn)高，但移液精度有保障；如果只是偶爾轉(zhuǎn)移特殊樣品，且財(cái)力有限，那么請(qǐng)您看看以下移液技巧，或許能幫助您提高移液精度。
移取揮發(fā)性樣品
在移液前務(wù)必對(duì)移液器潤(rùn)洗兩遍；吸液完成后要盡快排液。
多數(shù)情況下，移液器的移液對(duì)象是水溶液，但也難免會(huì)碰到一些特殊的樣品，如高揮發(fā)性樣品、高粘度樣品、高密度樣品等。如果需要經(jīng)常轉(zhuǎn)移這些特殊的樣品，建議購(gòu)買外置活塞原理的移液器，雖然耗材成本有點(diǎn)高，但移液精度有保障；如果只是偶爾轉(zhuǎn)移特殊樣品，且財(cái)力有限，那么請(qǐng)您看看以下移液技巧，或許能幫助您提高移液精度。
移取揮發(fā)性樣品
在移液前務(wù)必對(duì)移液器潤(rùn)洗兩遍；吸液完成后要盡快排液。
移取高粘度樣品
采用反向移液模式：
在吸液時(shí)把吸/排液按鈕按到第二檔（第二停止點(diǎn)），而在排液時(shí)把按鈕按到第一檔（第一停止點(diǎn)）。另外，在吸液和排液時(shí)均需要3～5秒的停留時(shí)間。
移取高密度／低密度樣品
移液器的精度數(shù)值都是基于轉(zhuǎn)移純水，如果樣品的密度與水的密度相差很大，那么精度也會(huì)相應(yīng)地差很多。因此在移液前需要先弄清楚樣品的密度，然后把量程調(diào)節(jié)成待轉(zhuǎn)移樣品體積與密度的乘積。例如一個(gè)樣品的密度是1.2g／cm3，需要轉(zhuǎn)移300μL，應(yīng)把量程設(shè)置為360μL。這只是粗略的調(diào)整方法，嚴(yán)格的調(diào)整方法還需要借助量器或天平作為輔助工具進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)算。
移取高溫／低溫樣品
