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放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-11-14
核心提示:分光光度法是指應(yīng)用分光光度計的分析方法,具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點。通常所測樣品溶液濃度下限可達10-6~10-5mol/L
分光光度法是指應(yīng)用分光光度計的分析方法,具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點。

通常所測樣品溶液濃度下限可達10-6~10-5mol/L,適用于測定食品中的微量組分(如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等)。


一、原理


1.1 物質(zhì)對光的選擇性吸收
當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時,光與物質(zhì)發(fā)生相互作用,產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均勻溶液,光的散射可以忽略。
1.1.1 溶液顏色的產(chǎn)生
當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時,一些波長的光被溶液吸收,另一些波長的光則透過溶液。
透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。
人把自身能感覺到的光定義為可見光。
在可見光區(qū),不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色,因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。
透射光與吸收光可組成白光,故稱這兩種光互為補色光,兩種顏色互為補色。



1.1.2 光吸收的本質(zhì)
當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時,組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”,光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上,是這些粒子由最低能態(tài)(基態(tài))躍遷到較高能太(激發(fā)態(tài)),這個作用稱為物質(zhì)對光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài),并以熱或熒光等形式釋放出能量。
分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級,僅當(dāng)照射光光子的能量hυ,與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時,才能發(fā)生吸收。
不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級,其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。
所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。



1.1.3 吸收曲線
吸收曲線,也稱為吸收光譜,描述了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力。
將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液,測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度(即吸光度),然后以波長為橫坐標,以吸光度為縱坐標作圖,繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質(zhì),在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大,但最大吸收波長不變。
若在最大吸收波長處測定吸光度,則靈敏度最高。
因此,吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。


1.2 光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律:
當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時,溶質(zhì)吸收了光能,光的強度就要減弱。
溶液的濃度越大,通過的液層厚度越大,入射光越強,則光被吸收的越多,光強度的減弱也越顯著。
該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù),是由實驗觀察得到的,不僅適用于溶液,也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度;
I0-入射光強度,cd;
I-透射光強度,cd;
ε-吸光系數(shù),L/(mol˙cm);
b-液層厚度(光程長度),cm;
c-有色溶液的濃度,mol/L。
其物理意義為:當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時,溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數(shù),數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度,ε值越大,方法的靈敏度越高。
由實驗結(jié)果計算ε時,常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度,實際上時表觀摩爾吸光系數(shù)。
在多組分體系中,如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用,體系的總吸光度等于各組分吸光度之和,即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比,即:
T=I/I0
因此:A=lg(1/T)


二、主要部件
盡管光度計種類型號繁多,但它們都是由相同的基本部件組成的,包括光源、單色器、吸收池和檢測系統(tǒng)。


2.1 光源
在測量吸光度時,要求光源發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜,要具有足夠的光強度,并在一定時間內(nèi)能保持穩(wěn)定。
在可見光區(qū)測量時,通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態(tài)時會發(fā)出波長在320~2500nm之間的連續(xù)光譜。
鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K,熔點為3680K。
鎢絲燈的溫度決定于電源電壓,電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化,因此必須使用穩(wěn)壓電源。
在紫外區(qū)測量時,常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生波長在180~375nm之間的連續(xù)光譜作為光源。
其理想光源應(yīng)具有覆蓋整個紫外可見光區(qū)的連續(xù)輻射,強度應(yīng)比較高,且隨波長變化能量變化不大,但在實際上難以實現(xiàn)。
氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍,壽命也比較長。氙燈的強度一般高于氫燈,但欠穩(wěn)定,波長范圍180~1000nm,常用作熒光分光光度計的激發(fā)光源。


2.2 單色器
單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成:入光狹縫、準光氣(一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束)、色散器、投影器(一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫)、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分,常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成,玻璃棱鏡色散能力強,但吸收紫外光,只能用于350-820nm波長的分析測定,在紫外區(qū)必須用石英棱鏡。
光柵的特點是:色散均勻,呈線性,光度測量便于自動化,工作波段廣。


2.3 吸收池
也稱為比色皿,是盛放樣品溶液的容器,具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平面。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm,也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定誤差,其材質(zhì)對光不是完全透明,在做定量分析時,對吸收池應(yīng)做配套性試驗,試驗后標記出放置方向。
紫外光區(qū)數(shù)值不跳為石英。


2.4 檢測系統(tǒng)
檢測系統(tǒng)包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備,將光強度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栵@示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大,不用放大,用于初級的分光光度計上,疲勞效應(yīng)嚴重。
光電倍增管利用二次電子發(fā)射來放大光電流,放大倍數(shù)可高達108倍,應(yīng)用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測,掃描速度快,可在0.1s內(nèi)完成對190-800nm波長范圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結(jié)果顯示裝置。
70年代采用數(shù)字讀出裝置。
現(xiàn)代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機,控制儀器操作和處理測量數(shù)據(jù),裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。


三、測量條件的選擇

3.1 顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇
進行比色分析或光度分析時,首先要把待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物,然后進行比色或光度測定。
將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng),與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。

3.1.1 顯色反應(yīng)的選擇
顯色反應(yīng)分兩類,即絡(luò)合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng),絡(luò)合反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。
選用的原則是:
1)選擇靈敏的顯色反應(yīng)。摩爾吸光系數(shù)ε的大小是顯色反應(yīng)靈敏度高低的重要標志,因此應(yīng)當(dāng)選擇生成的有色物質(zhì)的ε較大的顯色反應(yīng)。一般來說,當(dāng)ε為104-105時,可認為該反應(yīng)靈敏度較高。
2)盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數(shù)幾個組分發(fā)生顯色反應(yīng)。
3)顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質(zhì)最大吸收波長之差稱為對比度,一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
4)反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。


3.1.2 顯色條件的選擇
吸光光度法測定的是顯色反應(yīng)達到平衡后溶液的吸光度,因此要得到準確的結(jié)果,必須從研究平衡著手,了解影響顯色反應(yīng)的因素,控制適當(dāng)?shù)臈l件,使顯色反應(yīng)完全和穩(wěn)定。
1)根據(jù)溶液平衡原理,有色絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)越大,顯色劑過量越多,越有利于待測組分形成有色絡(luò)合物。但是過量顯色劑的加入有時會引起副反應(yīng),對測定反而不利。
2)酸度對顯色反應(yīng)的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反應(yīng)的適宜酸度范圍是通過實驗來確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度,改變?nèi)芤簆H值,測定其吸光度,作出吸光度-pH值關(guān)系曲線,選擇曲線平坦部分對應(yīng)的pH值作為測定條件。
3)顯色反應(yīng)一般在室溫下進行,有的反應(yīng)需要加熱,以加速顯色反應(yīng),使之進行完全。
4)大多數(shù)顯色反應(yīng)需要經(jīng)過一定的時間才能完成,其長短與溫度的高低有關(guān),也會受到空氣的氧化或發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)使眼色顏色減弱。因此必須通過實驗作出在一定溫度下的吸光度-時間關(guān)系曲線,得到適宜的顯色時間。


3.1.3 干擾的消除
1)干擾的類型
光度分析中,共存離子如本身有顏色,或與顯色劑作用生成有色化合物,都將干擾測定。
A.干擾離子本身有顏色
B.干擾離子本身無顏色,但能與顯色劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定,若生成的配合物無色,也降低了顯色劑的濃度,影響被測離子與顯色劑的反應(yīng),而產(chǎn)生誤差。
C.干擾離子與被測離子反應(yīng)生成配合物或沉淀,影響被測離子的測定。
2)消除干擾的方法
A.控制溶液酸度。
B.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩(wěn)定的化合物,使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。
C.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
D.選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞑ㄩL以消除干擾。
E.采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。


3.2 吸光度測量條件的選擇

3.2.1 入射光波長的選擇
應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線,選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。
如顯色劑與鈷絡(luò)合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷,則未反應(yīng)的顯色劑會造成干擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長處測定,在此波長下顯色劑不發(fā)生吸收。而鈷絡(luò)合物則有一吸收平臺。


3.2.2 參比溶液的選擇
1)如果僅待測物與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收,可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸?br /> 2)如果顯色劑或其他試劑略有吸收,應(yīng)用空白溶液(不加試樣的溶液)作參比溶液。
3)如試樣中其他組分有吸收,但不與顯色劑反應(yīng),則當(dāng)顯色劑無吸收時,可用試樣溶液作參比溶液,當(dāng)顯色劑略有吸收時,可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑,以此溶液作參比溶液。


3.2.3 吸光度讀數(shù)范圍的選擇
實踐證明,吸光度在0.2-0.5內(nèi)時,測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調(diào)整被測溶液的吸光度:
1)控制被測溶液的濃度。如改變?nèi)恿浚淖內(nèi)芤旱臐饪s倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。
2)選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿,吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。

四、應(yīng)用


4.1 應(yīng)用領(lǐng)域

4.1.1高含量組分測定-示差法
當(dāng)待測組分含量較高時,測得的吸光度值常常偏離朗伯-比爾定律。
即使不發(fā)生偏離,也因為通常采用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤海ㄆ胀ü舛确ǎ箿y得的吸光度太高,超出適宜的讀數(shù)范圍而引入較大的誤差。
采用示差法就能克服這一缺點。
但應(yīng)用示差法時,要求儀器光源有足夠的發(fā)射強度或能增大光電流放大倍數(shù),以便能調(diào)節(jié)參比溶液透光度為100%。
這就要求儀器單色器質(zhì)量高,電光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性好。


4.1.2 多組分分析
應(yīng)用紫外可見分光光度法,常常可能在同一試樣溶液中不進行分離而測定一個以上組分。
假定溶液中同時存在兩種組分x和y,其吸收光譜一般有重疊和不重疊兩種情況。
不重疊的測定組分相互不產(chǎn)生干擾。
若吸收光譜重疊,在波長為λ1和λ2時分別測定吸光度A1和A2,由吸光度值的加和性得到聯(lián)立方程,通過解聯(lián)立方程求得各濃度值。



4.2 定量方法
紫外可見分光光度分析的定量依據(jù)是光吸收定律,但具體操作方法卻有多種

4.2.1 標準曲線法
即工作曲線法,適用于大量重復(fù)的樣品分析,是工廠控制分析中應(yīng)用最多的方法。
根據(jù)光吸收定律,對于一種有色化合物,ε是一個定值,若把光程L也固定,那么吸光度A就和溶液的濃度c成正比,也就是說吸光度A和濃度c呈線性關(guān)系。
配制一系列適當(dāng)濃度的標準溶液,顯色后分別測定其吸光度,把吸光度A對濃度c作圖,即得工作曲線。


4.2.2 直接比較法

直接比較法其實質(zhì)也是工作曲線法,是一種簡化的工作曲線法。
配一個已知被測組分濃度為cs的標樣,測其吸光度為As,在同樣條件下再測未知樣品的吸光度為Ax,通過計算可求出未知樣品的濃度cx。
As=εcsL
Ax=εcxL
由于溶液性質(zhì)相同,比色皿厚度一樣,所以As/Ax=cs/cx
式中:
cs-已知被測組分的濃度,mol/L;
cx-未知樣品的濃度,mol/L;
As-已知被測組分的吸光度;
Ax-未知樣品的吸光度。
直接比較法簡化了繪制工作曲線的步驟,適用于個別樣品的測定。
操作時應(yīng)注意配制標樣的濃度要接近被測樣品的濃度,這樣能減少測量誤差。


4.2.3 標準加入法
標準加入法是工作曲線的一種特殊應(yīng)用。
選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件,先測定濃度為cx的未知樣品吸光度為Ax,再向未知樣品中加入一定量的標樣,配置成濃度為cx+Δc1、cx+Δc2……一系列樣品,分別顯色后再測定吸光度為A1、A2……最后在坐標紙上繪圖,以吸光度A為縱坐標,以濃度c為橫坐標,分別畫出Δc1、Δc2所對應(yīng)的A1、A2等各點,連成直線后延長,與橫軸的交點cx也就是未知樣品的濃度cs。
應(yīng)用標準加入法時要注意,加入的標樣濃度要適當(dāng),使畫出的曲線保持適當(dāng)角度,濃度過大或過小都會帶來測量誤差。
這種方法操作比較麻煩,不適于作系列樣品分析,但它適用于組成比較復(fù)雜,干擾因素較多而又不太清楚的樣品,因為它能消除背景的影響。


4.3 紫外可見分光光度計使用中的注意點
4.3.1 保護光源
光源燈有一定的壽命,儀器不工作時不要開燈,若工作間歇時間短,可不關(guān)燈。
一旦停機,則要待燈冷卻后再重新啟動,并預(yù)熱15min。
燈泡發(fā)黑或亮度明顯減弱或不穩(wěn)定時,就及時更換。
經(jīng)經(jīng)紫外光照射后形成結(jié)痕可用無水乙醇去除。


4.3.2 保證合適的工作環(huán)境
溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。
不適宜的溫度和濕度可引起機械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機械部分的誤差或性能下降;
造成光柵、反射鏡、聚焦鏡等光學(xué)部件的鋁膜銹蝕,產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等;
甚至使儀器停止工作,從而影響儀器壽命。
維護保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正溫度和濕度。
實驗室,特別是地處南方地區(qū)的實驗室,應(yīng)具備四季恒溫的儀器室,配備恒溫設(shè)備。
環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電耦合器的可靠性,也是造成光學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。
因此必須定期清潔,保障環(huán)境和儀器內(nèi)衛(wèi)生條件,防塵。


4.3.3 定期除塵、調(diào)校
儀器使用一定時間后,內(nèi)部會積累一定量的塵埃,最好由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進行除塵工作,同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固,對光學(xué)盒的密封窗口進行清潔,必要時對光路進行校準,對機械部分進行清潔和必要的潤滑,最后恢復(fù)原狀,再進行一些必要的檢測、調(diào)校和記錄。


4.3.4 正確使用比色皿
拿比色皿時,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。
清洗比色皿時,先用水沖洗,再用蒸餾水洗凈。若被比色皿被有機物沾污,可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1:2)浸泡片刻,再用水沖洗。每次做完實驗應(yīng)立即洗凈比色皿。
比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干,以保護透光面。
測定有色溶液吸光度時,一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次,以免改變有色溶液的濃度。在測定一系列溶液的吸光度時,通常都按由稀到濃的順序測定,以減少測量誤差。
若分光光度計噪音比較大,有可能是光源燈泡使用時間超過壽命期,可更換光源燈泡。
若自檢時提示波長自檢出錯,有可能是自檢過程中打開過儀器樣品室的蓋子,可關(guān)上儀器樣品室蓋子,重新自檢。



文章(文字)來源:食品論壇網(wǎng)友渾身是血原創(chuàng)。 
編輯:songjiajie2010

 
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