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在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：
(1)要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨(PH 5.16)做梯度洗脫，乙腈含量超過(guò)70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶等。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心；
(2)梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會(huì)被強(qiáng)的溶劑洗脫出來(lái)，用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時(shí)產(chǎn)生氣泡；
(3)混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)粘度會(huì)增大很多(甲醇-水體積比為1：1時(shí)壓力最大)，因此要防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力；
(4)每次梯度洗脫程序運(yùn)行完之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行徹底平衡，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)，需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相和初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡，平衡不好會(huì)影響下一針樣品的分離度和保留時(shí)間：下圖所示的平衡時(shí)間從從上到下分別為6、7、8、9分鐘，可以看出平衡6、7分鐘第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8、9分鐘所有峰保留時(shí)間變化不大，說(shuō)明色譜系統(tǒng)平衡充足；
(5)注意梯度洗脫用水的有機(jī)物殘留，往往在等度洗脫時(shí)用的水，在梯度洗脫時(shí)發(fā)生問(wèn)題(鬼峰)，這是因?yàn)樵谔荻冗^(guò)程中，水占的比例很高時(shí)的流動(dòng)相洗脫能力很低，此時(shí)水中的有機(jī)物殘留就被色譜柱吸附并濃縮，等到強(qiáng)溶劑占高比例時(shí)，濃縮的有機(jī)物被高洗脫能力的流動(dòng)相洗脫而流出色譜柱，并成為一個(gè)色譜峰，從而干擾分析；
(6)梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器(如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器)，而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器(如示差折光檢測(cè)器)。
文章來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)
(1)要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨(PH 5.16)做梯度洗脫，乙腈含量超過(guò)70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶等。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心；
(2)梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會(huì)被強(qiáng)的溶劑洗脫出來(lái)，用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時(shí)產(chǎn)生氣泡；
(3)混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)粘度會(huì)增大很多(甲醇-水體積比為1：1時(shí)壓力最大)，因此要防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力；
(4)每次梯度洗脫程序運(yùn)行完之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行徹底平衡，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)，需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相和初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡，平衡不好會(huì)影響下一針樣品的分離度和保留時(shí)間：下圖所示的平衡時(shí)間從從上到下分別為6、7、8、9分鐘，可以看出平衡6、7分鐘第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8、9分鐘所有峰保留時(shí)間變化不大，說(shuō)明色譜系統(tǒng)平衡充足；
(5)注意梯度洗脫用水的有機(jī)物殘留，往往在等度洗脫時(shí)用的水，在梯度洗脫時(shí)發(fā)生問(wèn)題(鬼峰)，這是因?yàn)樵谔荻冗^(guò)程中，水占的比例很高時(shí)的流動(dòng)相洗脫能力很低，此時(shí)水中的有機(jī)物殘留就被色譜柱吸附并濃縮，等到強(qiáng)溶劑占高比例時(shí)，濃縮的有機(jī)物被高洗脫能力的流動(dòng)相洗脫而流出色譜柱，并成為一個(gè)色譜峰，從而干擾分析；
(6)梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器(如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器)，而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器(如示差折光檢測(cè)器)。
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