DGGE、CGGE和TGGE三種方法是基于相同的原理而設(shè)計(jì)的突變檢測方法,它仍均是根據(jù)DNA的解鏈特性而設(shè)計(jì)。對于同一定序列組成或的DNA片段來說,它具有恒定的解鏈溫度(Tm),但若其序列發(fā)生改變時(shí),Tm值亦發(fā)生改變,在含有變性因素(變性劑,高溫)的凝膠半進(jìn)行電泳,當(dāng)其比鏈解開形成分叉時(shí),電泳遷移的速度就會改變。Tm值主要取決于DNA的堿基組成,序列中出現(xiàn)單堿基替換時(shí),Tm亦發(fā)生改變,電泳遷移率亦改變,此即DGGE、CDGE及TGGE鑒定突變的技術(shù)基礎(chǔ)。
1、變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis,DGGE)
DGGE是檢測基因突變故為精確的方法,它不僅可檢測單一片段的單點(diǎn)突變,對多點(diǎn)突變的檢測亦較容易,該方法與PCR技術(shù)相結(jié)合,使其能非?焖俚膶Υ罅繕(biāo)本進(jìn)行分析。
對于一DNA片段來說,其Tm值與基堿基組或有關(guān),當(dāng)其堿基組成發(fā)生變化時(shí),Tm值亦改變,因此,對于突變的片段來說,若其在一變性物質(zhì)線性梯度增加的凝膠上進(jìn)行電泳時(shí),隨著變性劑濃度的增加,當(dāng)這種濃度達(dá)一定值時(shí)突變的DNA片段發(fā)生解鏈而形成分叉,其電泳遷移速度變慢。因此突變的DNA片段與正常的DNA片段電泳的遷移位置有差別,研究證明DGGE可檢出任何糞型的單堿基取代,如果將突變型與正常的DNA片段形成異源雙鏈時(shí),其敏感性大大提高。
2、恒定變性膠電泳(Constant deratarared gel electrophoresis,CDGE)
CDGE是DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因突變檢測技術(shù),亦是利用突變基因與正;蚱伍gTm值的差異來檢測突變的方法,該方法與DGGE的區(qū)別在于聚丙烯酰胺中的含的變性劑濃度相當(dāng)于含突變基因片段的Tm值,而且濃度恒定,而不是線性遞增。為了提高DGGE和CDGE的檢測敏感性,通常在一側(cè)引物的5'端設(shè)計(jì)一含GC的區(qū)域(GC-ClampGC鉗),避免了DNA的完全解鏈,從而提高了突變的檢出率,可達(dá)100%。
3、溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)
該方法是將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量一中性聚丙烯酰胺凝膠上,在一溫度線性梯度上升的電場中進(jìn)行電泳,當(dāng)DNA雙鏈到達(dá)其Tm時(shí),雙鏈解開,形成分叉,而影響電泳遷移率,突變的擴(kuò)增產(chǎn)物其Tm值與野先型有明顯不同,因而有不同的解鏈區(qū),從而造成電泳遷移效率的差別,據(jù)此可判斷檢材中DNA有無突變。
由于DGGE及TGGE能區(qū)分不同DNA的堿基構(gòu)成,所以也越來越多地運(yùn)用到分析環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)。