眾所周知，ROS在細胞生命，應激和死亡中具介導作用，今天來聊下ROS。

ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細胞內產生的一種具有氧化活性的化學物質，包括過氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理條件下也會產生，但當其產生過多或清除不足時，會對細胞造成氧化應激，導致細胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測方法

目前有多種方法用于檢測ROS，包括熒光染色法、電子順磁共振技術（EPR）、化學發(fā)光法、色譜法、分光光度法、電化學生物傳感器以及基于熒光蛋白等七種。在這里，我們將著重介紹熒光染色法，以及其在檢測細胞內ROS時的原理和操作步驟。

檢測原理

目前，用于檢測細胞內ROS最廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過細胞膜。一旦進入細胞，它會被細胞內的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細胞膜，因此熒光探針會在細胞內積聚。細胞內的ROS能夠氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備，在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光信號。

檢測步驟：

1. 裝載探針

對于刺激時間較短(通常為2小時以內)的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。

2. 檢測

對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

注意事項

1、在完成探針裝載后，務必充分清洗，去除未進入細胞的探針殘余，以避免引發(fā)高背景信號。
2、探針裝載和清洗完成后，可執(zhí)行激發(fā)波長和發(fā)射波長的掃描，確保探針裝載狀況良好。
3、為降低各類誤差，建議盡量縮短探針裝載后至測定時的時間（刺激時間除外）。