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16、 PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。
17 、Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
答：這與目標(biāo)抗原的表達(dá)位置有關(guān)，對(duì)于胞漿和全細(xì)胞蛋白，可選擇內(nèi)參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內(nèi)參VCDA1/Porin和COXIV；核內(nèi)抗原可以選擇內(nèi)參Lamin B1、TBP和histone。
18、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低？
答：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉(zhuǎn)移效率；使用戊er醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉(zhuǎn)膜電壓/電流，增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。
19、轉(zhuǎn)膜時(shí)凝膠腫脹或卷曲？
答：可將凝膠在轉(zhuǎn)膜前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min。
20、跑膠的條帶歪斜或者漂移？
答：電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。
21、轉(zhuǎn)膜后膜上有單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？
答：轉(zhuǎn)膜時(shí)確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡。
22、轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？
答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過(guò)高，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中注意降溫。
23、顯影后膠片背景太高？
答：轉(zhuǎn)膜前PVDF膜沒(méi)有用100%甲醇全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數(shù)；封閉不全，選擇合適的封閉液和提高封閉時(shí)間；二抗?jié)舛冗^(guò)高，降低二抗?jié)舛龋灰豢固禺愋圆粡?qiáng)，換用特異性較強(qiáng)的單克隆抗體；曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，減少曝光時(shí)間。
24、結(jié)果沒(méi)有條帶或者條帶很淺，雜交信號(hào)很弱？
答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設(shè)置已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照；抗體稀釋比例太低，孵育時(shí)間不夠；轉(zhuǎn)膜不好，轉(zhuǎn)膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時(shí)間過(guò)短，增加曝光時(shí)間；抗體保存不當(dāng)，效價(jià)降低。
25、目的條帶位置偏低或者偏高？
答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。
26、有非特異性條帶？
答：目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙�；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結(jié)果，可設(shè)立一組不加一抗只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異性結(jié)合；樣品蛋白質(zhì)可能降解，提取蛋白時(shí)注意冰上操作，加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿�，避免樣品反�?fù)凍融；抗體濃度過(guò)高，降低一抗和二抗的濃度。
27、膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。二抗的HRP活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；二抗失活。
28、目的條帶是白色，周圍有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗?jié)舛绕�，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)。
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。
17 、Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
答：這與目標(biāo)抗原的表達(dá)位置有關(guān)，對(duì)于胞漿和全細(xì)胞蛋白，可選擇內(nèi)參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內(nèi)參VCDA1/Porin和COXIV；核內(nèi)抗原可以選擇內(nèi)參Lamin B1、TBP和histone。
18、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低？
答：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉(zhuǎn)移效率；使用戊er醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉(zhuǎn)膜電壓/電流，增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。
19、轉(zhuǎn)膜時(shí)凝膠腫脹或卷曲？
答：可將凝膠在轉(zhuǎn)膜前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min。
20、跑膠的條帶歪斜或者漂移？
答：電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。
21、轉(zhuǎn)膜后膜上有單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？
答：轉(zhuǎn)膜時(shí)確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡。
22、轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？
答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過(guò)高，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中注意降溫。
23、顯影后膠片背景太高？
答：轉(zhuǎn)膜前PVDF膜沒(méi)有用100%甲醇全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數(shù)；封閉不全，選擇合適的封閉液和提高封閉時(shí)間；二抗?jié)舛冗^(guò)高，降低二抗?jié)舛龋灰豢固禺愋圆粡?qiáng)，換用特異性較強(qiáng)的單克隆抗體；曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，減少曝光時(shí)間。
24、結(jié)果沒(méi)有條帶或者條帶很淺，雜交信號(hào)很弱？
答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設(shè)置已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照；抗體稀釋比例太低，孵育時(shí)間不夠；轉(zhuǎn)膜不好，轉(zhuǎn)膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時(shí)間過(guò)短，增加曝光時(shí)間；抗體保存不當(dāng)，效價(jià)降低。
25、目的條帶位置偏低或者偏高？
答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。
26、有非特異性條帶？
答：目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙�；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結(jié)果，可設(shè)立一組不加一抗只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異性結(jié)合；樣品蛋白質(zhì)可能降解，提取蛋白時(shí)注意冰上操作，加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿�，避免樣品反�?fù)凍融；抗體濃度過(guò)高，降低一抗和二抗的濃度。
27、膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。二抗的HRP活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；二抗失活。
28、目的條帶是白色，周圍有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗?jié)舛绕�，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)。
