1 簡介

本產(chǎn)品是用競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理來檢測生物樣本中的氯霉素含量。本試劑盒包含檢測所需的所有試劑——包括標(biāo)準(zhǔn)品。

檢測數(shù)量：96孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品）

檢測時間：20分鐘

 

2 應(yīng)用范圍

本試劑盒可用于檢測奶、組織（肌肉、肝臟、腎臟、蝦類、蟹類、魚類）、尿液、血液和飼料樣本中的氯霉素。

 

3 原理

反應(yīng)在包被了氯霉素抗體的固相微孔板上進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和酶標(biāo)物加入到微孔中，第一次溫浴時，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的游離氯霉素分子與酶標(biāo)記的氯霉素分子競爭結(jié)合吸附在固相上的抗體結(jié)合位點。沒有結(jié)合的分子被清洗除去，通過加入顯色底物來確定已經(jīng)結(jié)合的酶的活性，酶使得無色的底物轉(zhuǎn)變成蘭色，加入反應(yīng)終止液使得蘭色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm處讀出吸光度。顏色的深淺可以轉(zhuǎn)換為樣品中氯霉素的不同濃度。

 

4 試劑組成

微孔板：96孔（12×8，可分拆）直接包被氯霉素抗體

標(biāo)準(zhǔn)品：0.025ng/mL; 0.1ng/mL; 0.25ng/mL; 1ng/mL; 4ng/mL; 1ml含0.1ug/ml濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品1瓶

酶標(biāo)物凍干粉：玻璃瓶 1瓶

酶標(biāo)物稀釋液：13ml塑料瓶1瓶（棕色）

顯色劑：13ml 塑料瓶1瓶（棕色）

終止液：13ml塑料瓶1瓶（白色）

清洗液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）

氯霉素樣品稀釋液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）

 

5 需要但未提供的材料

樣品前處理需要：

 － 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷、三氯甲烷

 － 組織勻漿機(jī)、天平、水浴鍋，搖床（振蕩器）

 － 離心機(jī)，氮吹儀，混合振蕩器

檢測中需要：

－ 20～200ul移液槍和槍頭

－ 50～200ul多通道移液槍和槍頭

－ 配備450nm濾光片的酶標(biāo)儀

－ 擠瓶

 

6 注意事項

－ 終止液含有硫酸，注意不要接觸皮膚

－ 顯色劑有毒，不要接觸皮膚；如果接觸請用水沖洗

－ 不要在有效期過后使用試劑

－ 不同批號的試劑不要混用

 

7 保存

－ 2～8℃保存，切勿冰凍

－ 沒有使用的微孔條請務(wù)必用干燥劑保存在密封的袋子中

 

8 樣品前處理

8.1尿樣

8.1.1直接法

— 200µl尿樣與800µl氯霉素樣品稀釋液混合

— 混合物在2000g，離心10min

—     取50µl上清用于檢測

—     檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)5

8.1.2抽提法

建議對“深色/不潔”尿樣采用

— 1ml尿液用1M乙酸調(diào)PH值到4.8

— 加入25µl蝸牛液（Helix pomatia juice），37℃下溫浴過夜或55℃下溫浴2小時。

— 冷卻至室溫，并將PH值調(diào)節(jié)到7±0.5

— 加入2ml乙酸乙酯，混合1min。靜置5-10 min分層。

— 將1ml上層液（乙酸乙酯層）轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

— 50℃，氮吹儀吹干

— 用200氯霉素樣品稀釋液溶解，混勻

— 取50µl用于檢測

—     檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.4

8.2 血清/血漿樣品

— 1ml血清/血漿加入2ml乙酸乙酯混合1min，靜置5-10min，令其發(fā)生相分離

—     取1ml乙酸乙酯于一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹干

— 加入500µl氯霉素樣品稀釋液混合均勻

—     取50µl用于檢測

—     檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1

8.3 奶

8.3.1

— 2000g，離心15min，去除上層脂肪

— 取50ul用于檢測。

注意：檢測酸奶時，應(yīng)調(diào)樣品PH值至中性。

8.3.2

— 取5ml牛奶樣品于一試管中

— 2000g，離心15min，去除上層脂肪

—     取2.5ml脫脂奶于一新的試管

—     加入5ml乙酸乙酯，渦旋混合1min，靜置10min

—     取4ml乙酸乙酯上層到干凈玻璃管中

—     50℃，氮吹儀吹干

— 用200µl氯霉素樣品稀釋液溶解

— 取50µl用于檢測

— 計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.1

（脫脂奶粉處理方法：將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉，再按上述步驟操作）

8.4蛋類樣品

—     取1g勻漿全蛋

—     加入6ml乙酸乙酯渦旋混合1min

— 2000g離心10min

—     取3ml上層乙酸乙酯于一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹干

— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入500µl氯霉素樣品稀釋液，渦旋混合1min

— 2000g，離心10min

—     取50µl上層用于檢測

—     計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1

注意：若上層乳化，可將試管置于80℃水浴約5min，并再次進(jìn)行離心。

8.5 組織樣品（肉類、肝臟、蝦類、蟹類、魚類）

方法一：

— 取3g勻漿樣品

— 加入6ml乙酸乙酯渦旋混合，振搖10min

— 2000g，離心10min

—     取4ml乙酸乙酯上層于一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹干

— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入1ml氯霉素樣品稀釋液，渦旋混合1min

— 2000g，離心10min

—     吸取50µl上層用于檢測。

—     計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.5

注意：若上層乳化，可將試管置于水浴（80℃ ）約5min，并再次進(jìn)行離心。

另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心后應(yīng)完全去除上層正己烷，移取50µl下層用于檢測。

方法二：用于蝦、魚、蟹類的大樣品量處理

— 10g勻漿化樣品與20ml乙酸乙酯混合10min

— 2000g，離心10min（或用濾紙過濾）

—     取10ml乙酸乙酯層于一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹干

— 加入2ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或2ml正己烷，參見方法一），并加入1ml氯霉素樣品稀釋液，充分混合。若發(fā)現(xiàn)乳化，可將試管在水�。�80℃）中加熱（5min）。并將此溶液在2000g下離心10min。

— 利用巴斯德滴管轉(zhuǎn)移上層清夜（若用正己烷，清夜則在下層）于清潔玻璃管中。

— 再加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或1ml正己烷）。混合上述溶液并離心分離如上。

— 吸取50µl上層用于檢測（若用正己烷，清液則在下層）。

注：檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)0.2

8.6 蜂產(chǎn)品

8.6.1蜂蜜樣品

— 3g樣品與3ml蒸餾水充分混合

— 加入6ml乙酸乙酯充分振蕩混合10min

— 2000g離心10min

—     轉(zhuǎn)移4ml上層乙酸乙酯于一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹干

— 殘留物充分溶解于1ml氯霉素樣品稀釋液

— 吸取50µl用于檢測

對于不純凈的蜂蜜應(yīng)進(jìn)行脫脂處理：

— 將氮流蒸發(fā)后的殘留物溶于1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入1ml樣品稀釋液

— 渦旋混合1min，2000g，離心10min

注意：若上層乳化，可將試管置于水浴（80℃）約5min，并再次進(jìn)行離心。

—     吸取50µl上層用于檢測。

—     檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.5。

另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心后應(yīng)完全去除上層正己烷層，移取50µl下層用于檢測。

8.6.2蜂王漿

— 1g蜂王漿與4ml抽提緩沖液（10.1g 1-庚烷磺酸，11.4g Na3PO4.12H2O。溶于1000ml蒸餾水中，用H3PO4調(diào)整pH2.0）混合30min

— 3000g離心10min

— 取2.5ml上清液用Oasis HLB柱（60mg Waters公司W(wǎng)AT094226）按以下固相抽提步驟純化：

— 依次用1ml100％甲醇和1ml蒸餾水活化該柱（樣品過柱前柱不能過干，否則需要重復(fù)活化）

— 將上述2.5ml上清液真空抽濾過柱

— 用3ml蒸餾水及3ml 50％（1：1；V：V）甲醇洗柱，真空干柱

— 用1ml100％甲醇洗脫，用干凈玻璃管收集洗脫液

— 洗脫液在溫和氮流下蒸發(fā)甲醇

— 樣品殘留物溶入0.5ml氯霉素樣品稀釋液中

—     吸取50µl用于檢測

—     檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)1

注意：若無真空泵，可使用正壓洗滌柱子；

8.7 飼料樣品

— 5g樣品與20ml蒸餾水混勻

— 取5ml混合物到干凈玻管中，加入10ml乙酸乙酯混合2min

— 2000g離心10min

— 轉(zhuǎn)移5ml乙酸乙酯（上層）到干凈玻管中，50℃溫和的氮流下蒸發(fā)

— 殘留物溶于0.5ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入0.5ml氯霉素樣品稀釋液，混合液渦旋1min，

—     2000g離心10min

—     取50µl上層用于檢測

—     檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1

注：若發(fā)現(xiàn)乳化，可將試管在水�。�80℃）中加熱（5min），并將此溶液再次離心，吸取50µl上層清液檢測

注意：本說明書提供的樣品前處理方法僅作參考，實驗人員可以根據(jù)自己的經(jīng)驗作改善以提高檢測準(zhǔn)確度。

 

9 工作液準(zhǔn)備

為了避免污染，建議在配置標(biāo)準(zhǔn)品不要與試劑檢測工作在同一室內(nèi)進(jìn)行，并使用不同的移液槍。

注意：整套標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該在每個檢測實驗前臨時配置！！

氯霉素樣品稀釋液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9），注意：如果出現(xiàn)結(jié)晶，請將溶液放于室溫下?lián)u動，重新完全溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：使用已經(jīng)稀釋的氯霉素樣品稀釋液。

-         10ng/ml濃度：100ng/ml原始濃度溶液100ul +稀釋液900ul（1:10）

-         4ng/ml濃度：10ng/ml溶液400ul +稀釋液600ul（1:2.5）

-         1ng/ml濃度：4ng/ml 溶液 200ul +稀釋液600ul（1:4）

-         0.25ng/ml濃度：1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）

-         0.1ng/ml濃度：0.25ng/ml溶液400ul+稀釋液600ul（1:2.5）

-         0.025ng/ml濃度：0.1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）

此氯霉素樣品稀釋液也應(yīng)當(dāng)用于B0孔。

酶標(biāo)物：實驗前用12mL酶標(biāo)物稀釋液溶解，并充分混勻。靜置8小時（或過夜，但至少4小時），切勿渦旋混勻。

清洗液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9）。注意：如果出現(xiàn)結(jié)晶，請將溶液放于室溫下?lián)u動，重新完全溶解。

顯色劑：備用。

終止液：備用。

 

10 分析步驟

10.1 注意事項

－ 使用前請將試劑盒恢復(fù)到室溫（20～25℃）

－ 使用后請立即將所有試劑放回2～8℃

－ 請不要改動分析步驟，尤其：

－ 不同的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品使用一次性槍頭以避免交叉污染

－ 不要讓槍頭和微孔中的溶液或內(nèi)避接觸

10.2 檢測程序

1. 用記錄表記錄B0，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，要求做雙孔平行。

2. 加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品：

 －50ul氯霉素樣品稀釋液加入B0孔

 －標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50ul加入微孔

3. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul酶標(biāo)物溶液。

4. 晃動酶標(biāo)板。

5. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。溫浴過程中建議晃動酶標(biāo)板2～3次。

6. 清洗步驟：

 － 倒去微孔中的溶液

 － 用擠瓶將所有微孔加滿清洗液，然后倒去

 － 在吸水紙上拍打除去殘留溶液

 重復(fù)清洗四遍。

 不要讓微孔干燥。

7. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul反應(yīng)液。

8. 輕輕晃動酶標(biāo)板。

9. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。

10. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul的終止液。

11. 輕輕晃動酶標(biāo)板。

12. 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在10min內(nèi)讀取最佳，30min內(nèi)有效。

 

11 結(jié)果計算

－ 計算最大結(jié)合率（B0）、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度

－ 根據(jù)以下公式來計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的結(jié)合率

－ 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0值在半對數(shù)曲線中畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線

－ 獲得樣品的B/B0值后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以得到對應(yīng)的氯霉素濃度值ppb（ug/kg或ug/L），實際濃度還要乘上稀釋倍數(shù)。

 

12檢測下限

組織          0.1ng/g

尿液和奶樣    0.2ng/mL

 

13 特異性