適用

bioxl三聚氰胺檢測(cè)試劑盒是利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測(cè)定。

 

檢測(cè)原理

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過(guò)均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測(cè)定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過(guò)程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。在用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

 

提供試劑及材料

試劑盒在2-8ºC貯存（不要冷凍），請(qǐng)于盒上標(biāo)注日期前用完。

1．空包裝微孔板 （8×12條）.

2．4瓶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液2mL，濃度分別為 0,20,100, 500 µg/L (ppb) .

3．1 瓶 7 mL 三聚氰胺酶標(biāo)記

4．1 瓶 14 mL 底物.

5．1 瓶 14 mL 停止液. (注意: 1N 鹽酸, 勿接觸皮膚!).

6．操作說(shuō)明書.

 

注意事項(xiàng)

1．最好配套使用本試劑盒所提供的試劑，不要同其它公司的產(chǎn)品混用，不要將不同批次的產(chǎn)品混用。

2．樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。

3．不要使用過(guò)期的產(chǎn)品。

4．使用之前將所有試劑回升至室溫20-280C，但不要放置超過(guò)24小時(shí)。

5．三聚氰胺屬于有毒性的化學(xué)品，請(qǐng)小心處理。

6．停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。

 

試劑盒未提供的材料

1.    蒸餾水或去離子水..

2.    可吸取50ul的移液器及吸頭.

3.    可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.

4.    吸水紙或相當(dāng)?shù)奈�水材�?

5.    450nm的酶標(biāo)儀.

6.    計(jì)時(shí)器.

7.    20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.

8．清洗液：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml+.0.5 ml土溫20。

樣品制備

濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）

1.    均質(zhì)樣品至布丁狀。

2.    稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。

3.    超聲萃取1分鐘。

4.    漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。

5.    3000 g 室溫離心5分鐘。

6.    用玻璃纖維濾紙過(guò)濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。

7.    用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）

8.    移取150 ul 進(jìn)行分析。

注意：用此方法測(cè)定了8個(gè)添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率范圍為75%-117%。

本方法只可作為樣品篩選方法，不可作為最終確認(rèn)方法。

 

小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）

1.均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品。

2.稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。

3.漩渦混合并超聲萃取，使樣品溶解（確保樣品中沒有結(jié)塊）。

4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。

5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘。

6.用G6玻璃纖維濾紙過(guò)濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。

7.移取150 ul 進(jìn)行分析。

 

注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保證萃取效率。

操作人依據(jù)自己的判斷力，如果測(cè)試結(jié)果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進(jìn)行二次測(cè)定。

 

干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）

1.質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品。

2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。

3.超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。

4.3000 g 室溫離心5分鐘。

5.用G6玻璃纖維濾紙過(guò)濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。

6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）

7.移取

牛奶樣品

1直接法

—4℃，2000g離心l5min，撇去上層脂肪

—取50ul用于檢測(cè)。

注意：對(duì)于酸奶樣品，應(yīng)將pH值調(diào)節(jié)至中性再進(jìn)行檢測(cè)。

2抽提法

—5ml牛奶樣品，O-4℃，2000g離心l5min，撇去上層脂肪

—轉(zhuǎn)移2.5m1脫脂奶到玻管與5ml乙酸乙酯混合，渦旋1min，靜置5-10min令其發(fā)生相分離

—轉(zhuǎn)移4ml乙酸乙酯上層到干凈玻璃管中，50℃溫和氮流蒸發(fā)乙酸乙酯

—殘留物溶解于200ul稀釋緩沖液(2ml牛奶/200ul緩沖液)

—取50ul用于檢測(cè)

（脫脂奶粉處理方法：將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉，再按上述步驟操作）

 

 

免疫測(cè)定過(guò)程 (注意: 標(biāo)準(zhǔn)及樣品最好做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確度)

1.    將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放置超過(guò)24小時(shí)。

2.    從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮

3.    吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)、樣品到對(duì)應(yīng)微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶標(biāo)記溶液到每個(gè)小孔中。

4.    混合60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘。

6.    將微孔中的溶液倒入水槽中，用清洗液完全充滿微孔，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板。

7.    在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干。

8.    每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液。

9.    20-28攝氏度下，孵育30分鐘。

10. 每個(gè)微孔中加入100ul停止液。

11. 450nm下讀板。

 

結(jié)果分析

1.    半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡(jiǎn)單對(duì)比而來(lái)判定:樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高, 樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。

2.    定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對(duì)數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣吸光率的點(diǎn)畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對(duì)應(yīng)的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)樣的最底范圍高,比最高范圍低, 即可說(shuō)明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。

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