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一、概要
本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點，操作時間僅需1.5小時，能最大限度地減少工作強度和操作誤差。
二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三者的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺類藥物的殘留量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測動物組織（肌肉/肝臟/魚/蝦）、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
磺胺嘧啶（SD或SDZ）…………………………… 100.0%
磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）…… 98%
磺胺甲噁唑（SMZ）………………………………… 120.0%
磺胺噻唑（ST）……………………………………… 98.0%
酞�；青邕颍≒ST）………………………………… 62.8%
磺胺甲噻二唑…………………………………… 103%
磺胺吡啶…………………………………………… 51.9%
磺胺對甲氧嘧啶…………………………… 35%
五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置
┅┅均質(zhì)器振蕩器、洗耳球、容量瓶：500ml
┅┅渦旋儀、離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅玻璃試管：15ml
┅┅聚苯乙烯離心管：50ml
┅┅玻璃離心管：10ml
┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
----乙腈(分析純)（動物組織專用）
----乙酸乙酯(分析純)
----正己烷(分析純)
----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)
----二水合磷酸二氫鈉(分析純)
----氫氧化鈉(分析純)
----濃鹽酸
----去離子水
六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，2ppb，4ppb，8ppb，16ppb，32ppb
3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 1ppm
4、酶標(biāo)二抗 12ml …………………… 紅色帽
5、抗體工作液 10ml …………………… 綠色帽
6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液 7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液 7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液 40ml……………………… 透明帽
10、20×濃縮提取液 50ml……………………… 藍(lán)色帽
七、溶液的配制
配液1: 0.02M磷酸鹽緩沖液
稱取5.36g十二水合磷酸氫二鈉、0.2g二水合磷酸二氫鉀、8g氯化鈉和0.2g氯化鉀加去離子水溶解定容至1L
配液2: 0.5 M鹽酸溶液
量取41.7ml濃鹽酸加去離子水定容至500ml
配液3: 0.2 M 氫氧化鈉
稱取4g氫氧化鈉加去離子水定容至500ml
配液4: 提取工作液
用去離子水將20×濃縮提取液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮提取液+19份去離子水）用于樣本的提取，提取工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液5: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（或按需量稀釋）（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果
（c）所有樣本復(fù)溶后均不能保存
(一) 高檢測限樣本
（a ）動物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、雞蛋）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；
┅┅取上清液2ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷用渦旋儀渦動20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動1min，3000g以上離心10min；
┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。
（b）動物組織（魚、蝦）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml去離子水，用渦旋儀渦動至糊狀，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；
┅┅取上清液2.5ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加1ml正己烷用渦旋儀渦動20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動1min，3000g以上離心10min；
┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。
（二）低檢測限樣本提取方法
動物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入 10ml提取工作液，充分上下混合振蕩10min，再放入37℃恒溫箱，30min后取出，3000g以上，10℃離心10min；
┅┅取清亮上清20ml用于分析。
（三）血清前處理方法
┅┅將血樣本于室溫放置30min，3000g以上，10℃離心10min，分離出血清或過濾血清；
┅┅取1ml血清至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml 0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）混合均勻；
┅┅取20ml用于分析。
（四）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入2ml 0.5 M鹽酸溶液（見配液2），用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min；
┅┅加入5ml 0.2M氫氧化鈉（見配液3）（調(diào)pH值范圍為4～6）用振蕩器振蕩1min，再加入8ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心10min；
┅┅取上層液體至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1）溶解；
┅┅取20ml用于分析
（五）尿液前處理方法
┅┅將尿液于3000g以上，室溫（20-25℃）離心5min，直至尿液樣本清亮；
┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml提取工作液混合；
┅┅取20ml用于分析。
（六）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；
┅┅移取1ml離心后的牛奶樣本至10ml干凈的玻璃試管中，加入0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）按1︰19的體積比進(jìn)行稀釋（即20ml牛奶+380ml 0.02磷酸鹽緩沖液）；
┅┅取20ml用于分析。
九、檢測步驟
測定前應(yīng)須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對應(yīng)的微孔中，然后加抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液5）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標(biāo)二抗：加酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min，取出重復(fù)步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項8）。
9、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。
十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.211，樣本2的吸光度值為0.785，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.100；2ppb為1.680；4ppb為1.210；8ppb為0.580；16ppb為0.308；32ppb為0.120。則樣本1的濃度范圍是16ppb-32ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是4ppb-8ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
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百分吸光度值（%）＝
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B
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×100%
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|
B0
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B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物的實際濃度
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�
樣本稀釋倍數(shù)
組織樣品稀釋倍數(shù)
高檢測限樣本：
（a）方法處理肌肉/肝臟和雞蛋樣品稀釋倍數(shù)：2
（b）方法處理魚、蝦樣品稀釋倍數(shù)：2
低檢測限樣本
肌肉/肝臟： 5
血清樣品稀釋倍數(shù)：4
蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)：1
尿樣樣品稀釋倍數(shù)：4
奶樣樣品稀釋倍數(shù)：20
十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度：2ppb
樣本最低檢測限：
血清樣本/尿樣檢測下限…………………………………8ppb
牛奶樣本檢測下限………………………………………40ppb
組織樣本檢測下限
高檢測限
肌肉/肝臟和雞蛋……………………………………… 4ppb
魚、蝦…………………………………………………… 4ppb
低檢測限
肌肉/肝臟………………………………………………10ppb
準(zhǔn)確度：
雞肉/肝、豬肉/肝……………………………………75±10%
雞蛋…………………………………………………69±10%
蜂蜜、牛奶、血清……………………………………70±10%
精密度：
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
十二、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象
發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A和底物液B液后，一般顯色20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
十三、貯藏條件及保存期
貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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